本发明专利技术公开了新型抗人血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体。该单克隆抗体对VEGF有很高的亲和力，很低的免疫原性，并且其生物活性有显著提高。本发明专利技术还包含了所述单克隆抗体在研究及诊断治疗方面的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗体药物开发和生产
具体地，本专利技术涉及获得人血管内皮生长因子(hVEGF)不同表位的鼠单克隆抗体。同时，本专利技术还涉及单克隆抗体的人源化及其表达制备方法。
技术介绍
血管生成系统在许多疾病发展过程发挥着重要作用，如肿瘤、类风湿性关节炎、增生性视网膜病、牛皮癣(Klagsbrun 等人，Annu. Rev. Physiol. 53 :217-239,1991 ； Folkman J. J. Biol. Chem. 267 10931—10934，1992 ；禾口 Garner A, Vascular Disease In: Pathobiology of ocular disease. Adynamic approach. Garner A, Klintworth GK 编，2 版，Macel Dekker, NY, ppl625_1710，1994)。多数实体肿瘤生长是血管依赖性的，如果没有丰富血液供应氧气和营养物质，原发肿瘤不会超过2-3mm3(F0lkman J.N Engl J Med.，285 1182-1186，1971，Folkman J.N Engl J Med. ，333，1757-17631995)。血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成重要调节因子，在胚胎发育及出生后的血管发程中均起着极为重要的调节作用，主要参与新生血管的形成VEGF有至少五种不同大小的剪切形式，包括121、145、165、189和206个氨基酸等，其中VEGF121、VEGF145和VEGF165是分泌蛋白。VEGF受体包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。VEGF与内皮细胞膜上内皮生长因子受体(VGFR)结合后，使VEGFR二聚体化，受体酪氨酸激酶活性被激活，由受体自身磷酸化后启动下游信号通路如PKC信号通路。VEGF在肿瘤细胞中表达水平显著升高。高表达的VEGF 除了能够使血管内皮细胞分化增殖和迁移，促进血管的构建及生长，还能够提高血管的通透性、增加血浆蛋白溶酶激活物(PA)及血浆纤溶酶原激活物抑制剂-I(PAI-I)的表达，促进肿瘤的侵袭、转移。使用抗体靶向肿瘤特异抗原可以用来治疗肿瘤。鼠移植动物模型鉴定肿瘤抗原分为两种一种是肿瘤特异移植抗原；一种是肿瘤相关移植抗原。肿瘤特异移植抗原是指肿瘤中突变基因编码的蛋白，经过I型MHC被展示到细胞表面。人基因组单个细胞的恶性转化诱因包括化学诱因、放射性诱因和病毒诱因等。在基因组水平，这体现为病毒癌基因、细胞原癌基因、抑癌基因等癌症相关基因的突变。癌症相关基因功能多与细胞复制调控和细胞死亡调控直接相关。诱导细胞复制的原癌基因有编码生长因子和生长因子受体的，例如 sis编码一种血小板来源生长因子，fms、erbB和neu编码生长因子受体；有编码信号传导通路和转录因子的，例如src编码酪氨酸激酶，ras编码GTP结合蛋白，myc、jun和fos等编码转录因子。抑癌基因能够抑制过度细胞复制，例如Rb基因突变导致retinoblastoma， P53蛋白编码一个核磷酸蛋白。大部分癌症诱导和发展过程是多步骤的。例如人直肠癌发展过程表现出稳定的不同时期特征和依次经历系列的遗传突变。不能有效免疫激活和 /或免疫耐受可能是肿瘤晚期无法控制的原因，临床表现为恶性肿瘤形成和原发肿瘤临近淋巴结的肿大。肿瘤相关移植抗原包括肿瘤发展必须蛋白、细胞有丝分裂特异蛋白、肿瘤细胞组织特异性蛋白。血管内皮生长因子(VEGF)是主要的血管内皮生长因子，是恶性肿瘤组织新血管生成所必须的(Folkman等人，新英格兰医学杂志(N. Engl. J. Med.)观5 1182-1186(1971))。原位杂交研究表明，许多肿瘤VEGF是过度表达的，包括肺癌、乳腺癌、肾癌、和子宫癌等(M. Volm 等人，Int. J. Cancer 74 :64-68,1997 ；H. Yoshiji, Cancer Res. 56 :2013-2016,1996 ；Μ.Tomisawa, Eur. J. Cancer 35 133-137，1999 ；H.Μ. Sowter, Lab. Invest 77 :607-614,1997)。Genentech 公司生产的 VEGF 人源抗体 Bevacizumab 对非小细胞肺癌、直肠癌和乳腺癌均有疗效，其药理是体内注射VEGF抗体特异阻断VEGF的促新血管生成功能，从而抑制恶性肿瘤生长速度。VEGF抗体药物升级需要获得和研究针对VEGF不同表位的⑶R。不同⑶R免疫原性是不同的，这会造成抗体被耐受的速度和毒性的差异，直接影响药效。针对不同表位的CDR 与抗原结合的亲和力也会差别，高亲和力⑶R的抗体药物每针剂用量预期可以下调。鉴于 VEGF和其受体的多样性，针对VEGF不同抗原表位或者识别相同表位而亲和力不同的VEGF 抗体对肿瘤生长抑制的效果可能是不同的。抗体的疗效还受抗体血浆半衰期和血管穿透能力等因素的影响。因此研究识别VEGF不同抗原表位的抗体人源化改造将有助于获得疗效更好的治疗性抗体。人抗体分子包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgE 和 IgD 等。就 IgGl 而言，其序列去除CDR部分亦存在个体间差异。因此在抗体人源化过程中，需要考察不同人种IgG序列的个体间差异。
技术实现思路
本专利技术提供一种新的具有治疗前景的人源化VEGF抗体，能够在体外抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖，在体内抑制肿瘤的生长。本专利技术提供了一种针对血管内皮生长因子(VEGF)的人源化抗体，采用与鼠VEGF 抗体具有最高同源序列的人亚类共有序列的架构，即八K亚组II(V^II) 亚组I(VH I)，将鼠抗-VEGF抗体的CDR移植其上构建成人源化抗体。对该初始的人源化抗体序列上的关键框架残基进行改变，以减少免疫原性。本专利技术提供了一种人源化VEGF抗体，其中重链可变区VH的高变区具有如下氨基酸序列CDRHl (SEQ ID NO 1 :GYTFTDYNVA)，CDRH2 (SEQ ID NO 2 :DIDPNNGNTIYNQKFK)， CDRH3(SEQ ID NO 3 :YCARGAHW)。本专利技术还提供了优选的VEGF抗体轻链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序列 CDRLl(SEQ ID NO 4 :KSSQSLLDSDGKTYLN)，CDRL2(SEQ ID NO 5 :LVSKLDS),CDRL3(SEQ ID NO 6 =WQGTHFPffT)。本专利技术提供了一种VEGF抗体，其重链可变区具有SEQ ID NO 7所示氨基酸序列和序列表1所示核苷酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO 8所示序列和序列表2所示核苷酸序列，人源化抗体重链可变区具有SEQ ID NO 9所示序列，轻链可变区具有SEQ ID NO 10 所示序列。本专利技术还包括各种形式的该人源化抗体，例如，可以是全长的抗体，也可以是抗体片段(如Fab，Fab’或者F(ab’)2)，以及抗体与药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶等偶联，组成免疫偶联物。本专利技术还提供了序列表3所示的最短人泛素S27A启动子，该序列长度为沈9，能与CMV增强子序列共同作用提高外源基本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种人源化抗ＶＥＧＦ单克隆抗体，它具有重链可变区，该重链可变区含有如下氨基酸序列的三个高变区：ＣＤＲＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ＧＹＴＦＴＤＹＮＶＡ），ＣＤＲＨ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＤＩＤＰＮＮＧＮ ＴＩＹＮＱＫＦＫ），ＣＤＲＨ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：ＹＣＡＲＧＡＨＷ）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯杰，高静，邵长君，
申请(专利权)人：中国科学院北京基因组研究所，
类型：发明
国别省市：11
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