本发明专利技术公开了一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌及制备方法和应用，其步骤：A、解淀粉芽胞杆菌的筛选分离：采集分蘖期的水稻，将水稻根部冲洗，以乙醇浸泡消毒，将水稻根部切块，置于培养基上培养，获得单菌落；B、检测细菌的抑菌活性：将分离得到的细菌以PD液体培养，检测抗菌活性；C、细菌的分类鉴定：对检测到显著抗真菌活性的细菌进行形态鉴定；D、细菌培养和保存：培养解淀粉芽胞杆菌的条件为PD培养基，菌株于低温保存。该菌在制备治疗或预防油茶炭疽病药物中的应用：方法易行，操作简便，脂肽以其抗菌谱广、抗菌作用强、稳定性好，防治效果稳定，其产生的抗菌物质-脂肽活性稳定，抗高温、抗蛋白酶解，是一种高效稳定的抗菌物质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业微生物学
，具体涉及一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌，同时还涉及一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的制备方法，还涉及一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的用途。
技术介绍
很多芽胞杆菌可以通过产生脂肽抑制真菌的生长。脂肽之所以能够抑制真菌的生长，是由于其两亲的结构决定的，脂肽与细胞膜相互作用可以导致膜穿孔造成原生质泄露，使得菌丝体断裂；脂肽还可以通过溶解病原菌孢子的细胞壁或细胞膜，致使细胞壁穿孔、畸形等从而抑制孢子萌发，见参考文献(祁高富；赵秀云；朱发银；文凯；张世超；喻子牛。一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌及由该菌制备的脂肽与应用。专利号 CN200810197403. 4)。申请人:所在单位从水稻根部分离到一株解淀粉芽胞杆菌CH1，经过发酵可以产生脂肽类表面活性素，该脂肽对水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、棉花枯萎病菌、小麦赤霉病、棉花炭疽病菌、杨树溃疡病菌、灰霉菌等多种植物病原真菌具有显著的拮抗效果。进一步研究发现，该脂肽对真菌的抑制作用原理不但包括使真菌菌丝发生坏死，而且包括在浓度较低时诱导真菌发生细胞凋亡，见参考文献Oli，G.F.，Zhu, F. Y.，Du, P，et al. Lipopeptide induces apoptosis in fungal cells by a mitochondria-dependent pathway. 020P印tides，2010，31 :1978-1986 和林福呈，李德葆，枯草芽孢杆菌(Bacillus 训计丨1化)59对植物病原真菌的溶菌作用，植物病理学报，2003，33 :174-177)。在载玻片上分别接种CHl和水稻纹枯病菌进行对峙实验，结果发现在载玻片上受到抑制的水稻纹枯病菌出现了明显的细胞凋亡现象，却没有检测到相应的细胞坏死特征， 推测在自然环境下芽胞杆菌类的拮抗细菌，如枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌等，产生的脂肽浓度不足以使病原真菌坏死，通常是通过诱导真菌细胞凋亡的形式来抑制病原真菌的生长。当前，化学农药的使用已经在全球造成了严重的生态破坏和环境污染，使用高效低毒的生物农药是农业发展的必然趋势。本实验中对CHl的发酵优化首先采用 Plackett-Burman设计筛选出对脂肽产量有显著影响的因素，然后用田口设计得到了培养基各组分的最优组合。发酵液后处理采用喷雾干燥方式进行，喷雾干燥中，高压气流使发酵液形成超细液滴，使发酵液瞬时干燥，最大限度的降低了高温对发酵液中活性成分的伤害， 保留了抑菌活性。本研究还通过田间苗圃实验对CHl粉末的药效进行了检测，并与常用的化学杀菌剂进行了比较，为脂肽类生物农药的研究和使用提供了参考。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的是在于提供了一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌，该菌能产生促真菌凋亡的一种脂肽，可作为抗植物病原菌的有效成分。该菌对 Rhizoctonia solani，Helminthosporium maydis，Fusarium oxysporium, Botrytis cinereapers， Gibberella zeae， Dothiorella gregaria， Colletotrichum gossypii等植物病原真菌都有明显的抗菌效果。发酵液对油茶炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)抑制效果显著。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的制备方法，对该菌的发酵培养基、发酵条件和发酵液的后处理方法进行了摸索和优化，对发酵液进行低压浓缩和喷雾干燥后处理，喷雾干燥后得到的粉末药效存留率为86. 2%。该粉剂使用方便，可长期储存于室温，药效稳定，兑水稀释后喷雾施用，可用于田间大面积防治油茶炭疽病等真菌病害。本专利技术的还有一个的目的是在于提供了一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌在制备治疗或预防油茶炭疽病药物中的应用。苗圃实验证明，喷雾干燥粉末能够很好的防治油茶炭疽病。粉剂稀释1000倍后用于田间苗圃实验，防治油茶炭疽病菌，解淀粉芽胞杆菌 (B. amyloliquefaciens)CHl粉剂的防效高于常用的化学农药，防效高达74. 4% ；70%甲基托布津可湿性粉剂，防效达59. O%，50%多菌灵可湿性粉剂仅为48. %。表明该菌可有效防治油茶炭疽病菌，且与化学农药相比，对环境无污染，对人畜不会造成伤害。该菌可用于防治油茶炭疽病，有利于生产高品质的无公害植物油。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施一种真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的制备方法，其步骤是1.解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的筛选分离从水稻田采集分蘖期的中花11水稻，将水稻根部外表面以自来水冲洗干净，再以无菌水冲洗2-4次，然后以70% (ν/ν)乙醇浸泡消毒^-3 ，以无菌水冲洗2-4次后，将水稻根部切成约Imm大小的碎块，置于PDA培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，20g琼脂，加蒸馏水至1L)上于培养46-50h，获得单菌落。2.检测细菌的抑菌活性将分离得到的细菌以PD液体培养基(含200g马铃薯煮出液，20g葡萄糖，加蒸馏水至1L)于观！，振荡培养，发酵上清液以0. 22 μ m滤膜过滤后， 与PDA培养基按体积比混合倒平皿接种水稻纹枯病菌(华中农业大学植保系植物病理教研室)，见参考文献(云月利，徐冠军.斑蝥素对植物病原菌抑制作用的研究.湖北大学学报 自然科学版，2003，25 (4) =342-345)，检测抗菌活性。3.细菌的分类鉴定对检测到显著抗真菌活性的细菌进行16SrRNA和形态鉴定。用常规方法提取细菌的基因组DNA，见参考文献(萨姆布鲁克等著，金冬雁等译.分子克隆实验指南第二版.北京科学出版社，1999)，以16SrRNA的通用引物进行PCR。扩增产物进行序列测定后在NCBI中经Blast比较分析确定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 04.细菌培养和保存方法培养解淀粉芽胞杆菌的条件为PD培养基或者LB培养基，28°C -37°C培养。菌株保存方法取培养好的Bacillus, amyloliquefaciens CHl菌液添加灭菌甘油至终浓度25%于-80°C保存。申请人:通过对湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的一株解淀粉芽胞杆菌(保藏编号为CCTCC NO :M208127)进行发酵优化和发酵放大，并对发酵液进行低压浓缩和喷雾干燥后处理，发现喷雾干燥后保留了大部分抑菌活性，苗圃实验证明，喷雾干燥粉末能够很好的防治油茶炭疽病。一株分离的产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌菌株，解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciensKHl，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC :M208127，保藏单位地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2008年9月5日。解淀粉芽胞杆菌CHl (Bacillus, amyloliquefaciens CHl)的菌学特征解淀粉芽胞杆菌CHl革兰氏阳性，菌体杆状，菌体大小1-1. 4 μ mX 2. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一株分离的产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌菌株，其特征在于：解淀粉芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＣＨ１，ＣＣＴＣＣ：Ｍ２０８１２７。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵秀云，祁高富，信姗姗，王圣英，李菁菁，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83
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