一种制备脱细胞基质的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用磷脂酶制备脱细胞基质的方法，其特征在于：待用组织器官预处理；待用组织器官加入到包含有磷脂酶的溶液中，在受控条件下制备脱细胞基质；洗涤制备的脱细胞基质。本发明专利技术可获得具有良好物理学性状和生物学功能的脱细胞基质，不但是组织工程的重大突破，也直接为临床疾病的治疗开拓了新途径。本发明专利技术原理可靠，工艺简易灵活，产品重现性好，极易实现产业化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于组织工程领域，具体地说是涉及。技术背景来源于脱细胞基质的各种生物支架材料，在动物实验的临床前研究和人种疾病的临床应 用中，己经取得了成功。通过去除各种组织器官中异种或同种异体细胞，保留其中复杂的结 构和功能蛋白，即可得到相应组织器官的脱细胞基质。不同的脱细胞方法直接影响所得脱细 胞基质的成分和超微结构，最终影响移植后宿主对脱细胞基质的反应。现行脱细胞基质的制备方法主要包括l物理法；2化学法；3酶法。物理法指的是通过冷冻，高压，超声波，渗透压改变等物理方式破坏细胞，其优点在于得到的脱细胞基质没有其他外加成分的残留，但这种方法的最大缺点是在破坏细胞的同时也不同程度的破坏了细 胞外基质的超微结构，同时破裂的细胞碎片一定要通过其他方式予以清除，这种清除过程会 进一步破坏细胞外基质的超微结构。化学法包括使用某些酸、碱、表面活性剂等化学方法裂 解细胞。这种方法其优点在于脱细胞过程短，速度快，但这种方法同样会破坏细胞外基质的 超微结构，并且还会造成某些基质成分(如蛋白多糖)的丢失。酶法主要使用各种蛋白酶(如 胰蛋白酶，中性蛋白酶)核酸酶(核酸外切酶，核酸内切酶)，通过水解细胞蛋白成分和核酸 成分达到破坏细胞的目的。蛋白酶可以有效地去除细胞成分，但由于胰蛋白酶和中性蛋白酶 的作用底物比较广泛，造成细胞外基质中的结构和功能蛋白大量降解。核酸酶选择性的降解 核酸，不会造成细胞外基质成分的破坏，但其分子量过大，极易引起免疫反应。在组织工程中良好的支架材料应具有以下技术要求:①良好的生物相容性，自身及其降 解产物对机体无毒性,不引起排斥反应和炎性反应，不致突变、畸变;②材料携带具有生物诱导 性的多种细胞生长因子，诱导自体细胞生长繁殖;③支架材料的降解速率与植入脱细胞基质 的细胞形成组织器官的速率相匹配。在支架完成其功能后可被完全吸收或与新生的组织融合; ④可按各组织的特点和缺损情况进行塑形，达到完善修复;⑤具有一定的韧性和可加工性，能 形成三维立体结构，为细胞进行物质代谢提供足够空间。现有研究表明利用脱细胞基质作为 组织工程的支架材料具有来源广泛，可降解，有良好的生物相容性的特点，特别是材料可预先 按修复组织大小和厚薄设计，更适于各种组织病变的修复重建。因此，如何获得具有以上5项技术要求的脱细胞基质成为组织工程亟待解决的重大课题。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供，该方法可制备到具有较 好物理学性状和生物学功能的脱细胞基质。 解决上述技术问题的技术方案如下 ，包括以下步骤-a. 将待用组织器官预处理；b. 将经过预处理的待用组织器官加入到包含有磷脂酶的溶液中,通过低渗或等渗液 浸泡制备脱细胞基质，其中，磷脂酶的浓度小于10000U/ml;c. 洗涤制备的脱细胞基质本专利技术一种利用磷脂酶制备脱细胞基质的方法的技术方案是选择专一性更强的包含有磷 脂酶的溶液特异性水解待用组织器官中细胞的磷脂成分，达到脱去细胞而不损伤细胞外基质 的目的。同时也可以辅以化学法，使用对细胞外基质成分影响很小的一种或一种以上表面活 性剂，以加快磷脂酶的脱细胞作用。另外，根据各种组织的脱细胞要求的不同，可以再辅以 物理方法进一步加快磷脂酶的脱细胞速度。所述的待用组织器官包含有异种或同种异体或自体组织器官。可为皮肤，心瓣膜、血管、 膀胱、韧带、软骨、神经中的任一种，也可以为角膜、巩膜、结膜中的任一种或其任意组合 体。 '所述的预处理指的是使用包含抗生素的生理缓冲液对待用组织器官进行常规清洗、消毒、 分离。还可以包括低渗或等渗浸泡，震荡，调节洗涤温度，适当频率和强度的超声波处理所述的磷脂酶包含有磷脂酶Ap A2， Bp B2， C， D中的任一种或一种以上。。所述的磷脂酶的浓度范围小于10000U/ml，优选l-1000U/ml。含有磷脂酶溶液的温度范 围为0-56'C，含有磷脂酶溶液的pH值范围为5-12。在利用低渗或等渗浸泡，震荡时，可以调节反应温度，适当频率和强度的超声波处理等 物理方法进一步加快磷脂酶的脱细胞速度。所述的表面活性剂指的是生物体内可以生成的具有表面活性作用的成分，或指的是人体 内可以生成的具有表面活性作用的成分。所述的表面活性剂包含有聚乙二醇，TritonX-100,胆酸盐，脱氧胆酸盐，鹅脱氧胆酸盐， 甘氨胆酸盐，甘氨鹅脱氧胆酸盐，牛磺胆酸盐，牛磺鹅脱氧胆酸盐，脂多糖，脂蛋白，溶血卵磷脂等种成分或其任意组合。所述的洗涤指的是使用可以包含抗生素的生理缓冲液对所得脱细胞基质进行常规清洗。本专利技术选用磷脂酶对待用组织器官进行脱细胞处理，其优点在于1. 是一种高活性的、特异性的水解磷酯键的酶。而构成细胞膜的主要成分就是各种磷脂，因 此使用磷脂酶脱细胞特异性强，对细胞外基质中的结构和功能蛋白没有损伤作用。2. 磷脂酶分子量小，微量残留时能够引起免疫反应的可能性极小。此外残留微量的磷脂酶还 具有广谱的抗感染，抑制炎症作用，因此对人体无害。3. 磷脂酶对于完整细胞膜的作用大于对细胞膜碎片的作用。因此可以优先裂解完整的细胞。4. 表面活性剂可以明显地促进磷脂酶的水解反应。各种表面活性剂本身也具有脱细胞功能， 但其在脱细胞的同时可不同程度的破坏细胞外基质中的蛋白成分，造成各种具有重要功能 的蛋白质丧失其生物学功能。但是表面活性剂在本专利技术中可以明显促进磷脂酶的水解反 应，加快了水解反应速度。本专利技术优选的表面活性剂具有以下特征(1)能明显促进磷脂 酶的脱细胞效果。(2)本身对细胞外基质中的结构和功能蛋白造成的损伤较小。如 TritonX—100和脱氧胆酸钠，有一个大而且刚性的极性基因，较难进入蛋白质表面的裂缝， 使得细胞外基质蛋白四级结构受到较小影响。(3)在使用表面活性剂时，在保证提高磷脂酶 活性，促进磷脂酶水解反应的前提下，最大限度的降低表面活性剂的使用浓度，本领域的 技术人员根据现有理论可以灵活的加以实施。(4)优先选用来源于生物体或人体的表面活性 齐U，这种表面活性剂最大的优点在于其微量的残留物不影响人体正常的生理功能。因此本 专利技术更优先选用胆酸盐，脱氧胆酸盐，鹅脱氧胆酸盐，甘氨胆酸盐，甘氨鹅脱氧胆酸盐， 牛磺胆酸盐，牛磺鹅脱氧胆酸盐，脂多糖，脂蛋白，溶血卵磷脂中的任一种或一种以上。5. 为了进一步增强磷脂酶的脱细胞效果，可以采用物理方式对待用组织器官进行处理。本发 明主要采用物理法中低渗或等渗浸泡，震荡，调节温度，适当频率和强度的超声波等常规 方式，增加磷脂酶的脱细胞效果。6. 磷脂酶在不同pH值、温度、浓度条件下具有不同的水解速度，因此，可以通过调节这些 参数来灵活控制磷脂酶的水解速度，以适应不同组织器官的脱细胞要求。综上所述，本专利技术选用磷脂酶对待用组织器官进行脱细胞处理，根据各种组织器官的脱 细胞要求，可以采用以磷脂酶为主的方式，也可以采用磷脂酶加表面活性剂以提高磷脂酶水 解速度的方式，还可以进一步加入某些物理方式强化磷脂酶的脱细胞效果。并可随时调整反 应体系的pH值、温度、磷脂酶浓度，高度灵活的控制磷脂酶的脱细胞程度和速度。通过本6专利技术所述方法，可获得具有良好物理学性状和生物学功能的脱细胞基质，不但是组织工程的 重大突破，也直接为临床疾病的治疗开拓了新途径。本专利技术原理可靠，工艺简易灵活，产品 重现性好，极易实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备脱细胞基质的方法，其特征在于，包括以下步骤：　　　　ａ．将待用组织器官预处理；　　　　ｂ．将经过预处理的待用组织器官加入到含有磷脂酶的溶液中，通过低渗或等渗液浸泡制备脱细胞基质，其中，磷脂酶的浓度小于１００００Ｕ／ｍｌ；　　　　ｃ．洗涤制备的脱细胞基质。

【技术特征摘要】
1.一种制备脱细胞基质的方法，其特征在于，包括以下步骤a.将待用组织器官预处理；b.将经过预处理的待用组织器官加入到含有磷脂酶的溶液中，通过低渗或等渗液浸泡制备脱细胞基质，其中，磷脂酶的浓度小于10000U/ml；c.洗涤制备的脱细胞基质。2. 根据权利要求1所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于所述的磷脂酶为磷脂酶Ap A2, B!， B2， C， D中的任一种或一种以上。3. 根据权利要求1所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于所述的磷脂酶的浓度范围为l-1000U/ml。4. 根据权利要求1所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于步骤b中含有磷脂酶的溶液中还含有表面活性剂。5. 根据权利要求1一4任一项所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于步骤b中在浸泡时进行震荡，或超声波处理。6. 根据权利要求1一4任一项所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于步骤b中溶液的温度范围为0-56°C， pH值范围为5-12。7. 根据权利要求4所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于所述的表面活性剂为生物体内或人体内可以生成的具有表面活性作用的成分。8. 根...

【专利技术属性】
技术研发人员：王智崇，陈冬，武征，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]