一种脱细胞异种真皮及其制取方法技术

本发明专利技术公开了一种脱细胞异种真皮及其制备方法，其制备方法包括猪真皮片获取保存以及脱细胞处理，猪真皮片保存时添加有冷冻防护剂，脱细胞处理采用温和洗涤剂打破细胞。本发明专利技术无需反复冻融，冷冻的过程中添加有冷冻防护剂，减少了对胶原蛋白的生物活性的破坏，有利于创面的尽快恢复；通过核糖核酸酶溶液有效去除残留核糖核酸，避免了残留核糖核酸引起不良的反应；通过alpha-半乳糖苷酶溶液有效的去除alpha-半乳糖，减轻甚至避免了alpha-半乳糖引起人体的急性免疫反应；通过在防辐射保护剂里进行电子束端灭菌或者在干冰条件下的γ辐照，灭菌的同时降低了辐射对猪真皮片的损害；通过采用铝箔里外双层袋包装，便于医生打开使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学烧伤及整形专科临床应用医用材料领域，具体是指一种脱细胞异种真皮及其制取方法。
技术介绍
众所周知，在医学烧伤及整形专科临床中，严重创伤及大面积烧伤患者存在皮肤缺失的巨大创面，在治疗中消灭创面需要进行皮肤移植，使用的皮源可以为同种真皮和异种真皮。由于同种真皮来源不足，目前，皮肤移植主要采用异种真皮。使用异种真皮进行皮肤移植存在一个关键的技术要点：要在脱细胞时最小限度的损坏真皮基质的三维结构，同时保障胶原蛋白具有充分的生物活性，以提供必要的环境和生长因子促进创面的修复。以公开号为CN103520773A和CN103520772A的专利申请为例，目前对于异种真皮脱细胞处理通常采用的反复冻融达到破坏细胞的目的。反复冻融技术虽然能够有效的破坏细胞，但是在每次冻融的过程中均会导致胶原蛋白损伤，不利于创面的恢复。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：克服现有技术上述缺陷，提供一种脱细胞异种真皮及其制备方法。该种脱细胞异种真皮，在实现脱细胞的同时，避免了反复冻融，能够最大限度的保障胶原蛋白的生物活性，利于创面的恢复。本专利技术通过下述技术方案实现：一种脱细胞异种真皮制备方法，依次包括以下步骤，步骤A：制取猪真皮片；步骤B：对猪真皮片进行消毒处理；步骤C：使用磷酸盐缓冲盐水充分清洗消毒后的猪真皮片；步骤D：将猪真皮片与冷冻防护剂充分混合后保存在冻箱中备用；步骤E：取出冷冻猪真皮片在室温下融化，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片；步骤F：加入脱细胞液，将猪真皮片与脱细胞液充分混合以及反应，所述脱细胞液含有温和洗涤剂；步骤G：吸出脱细胞液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。作为一种优选的方式，所述冷冻防护剂为甘油水溶液或多糖，当冷冻防护剂为甘油水溶液时，甘油的体积百分比浓度为20%或大于等于30%；当冷冻防护剂为多糖时，所述冷冻防护剂为葡聚糖凝胶、蔗糖和天然蜂蜜中的一种或者几种。作为一种优选的方式，所述步骤D中还添加有乙二胺四乙酸。作为一种优选的方式，所述脱细胞液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其PH值为8，每升4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液含20毫摩尔4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述温和洗涤剂为十二烷基聚乙二醇醚、乙基苯基聚乙二醇和脱氧胆酸钠中的一种或者几种，当所述温和洗涤剂为脱氧胆酸钠时，脱氧胆酸钠的质量体积百分比溶度为2%。作为一种优选的方式，所述脱细胞液中还添加有乙二胺四乙酸。作为一种优选的方式，所述脱细胞液体积与猪真皮片体积之比为30:1。作为一种优选的方式，步骤G之后还依次具有下列步骤，步骤H：加入核糖核酸酶溶液，并进行充分混合以及反应，所述核糖核酸酶溶液内的核糖核酸酶通过人工重组合成或直接从动物组织提取，所述核糖核酸酶溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，每升4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液含20毫摩尔4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2.5毫摩尔氯化镁、0.5毫摩尔氯化钙以及0.5克核糖核酸酶，其PH值为8，核糖核酸酶溶液体积与猪真皮片体积之比为20:1；步骤I：吸出核糖核酸酶溶液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。作为一种优选的方式，步骤I之后还依次具有下列步骤，步骤J：加入alpha-半乳糖苷酶溶液进行充分混合以及反应，所述alpha-半乳糖苷酶溶液通过柠檬酸盐缓冲液添加alpha-半乳糖苷酶制得；步骤K：吸出alpha-半乳糖苷酶溶液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。作为一种优选的方式，步骤K之后还依次具有下列步骤，步骤M：加入保存液进行充分混合，保存液为磷酸盐缓冲盐水，其内含乙二胺四乙酸以及体积百分比溶度为20%的甘油；步骤N：取出猪真皮片，包装在铝箔里外双层袋中；步骤O：对步骤N中包装好的铝箔里外双层袋进行灭菌处理，所述灭菌处理为在防辐射保护剂里进行电子束灭菌、在干冰条件下的γ辐照灭菌、超临界二氧化碳处理和环氧乙烷灭菌中的一种。一种脱细胞异种真皮，采用上述方法制得。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：（1）本专利技术与反复冻融技术相比，采用温和洗涤剂打破细胞，无需反复冻融，且在冷冻的过程中添加有冷冻防护剂，有效的阻止了冰晶的生产，减少了对胶原蛋白的生物活性的破坏，有利于创面的尽快恢复；（2）本专利技术通过核糖核酸酶溶液能够有效的去除残留的核糖核酸，避免残留的核糖核酸引起烧伤创面的不良反应；（3）本专利技术通过alpha-半乳糖苷酶溶液能够有效的去除alpha-半乳糖，减轻甚至避免了alpha-半乳糖引起的人体急性免疫反应，减少了alpha-半乳糖对烧伤创面的负面影响，有利于尽快恢复；（4）本专利技术通过在防辐射保护剂里进行的电子束端灭菌或者在干冰条件下的γ辐照，能够在灭菌的同时降低了辐射对猪真皮片的损害；（5）本专利技术通过采用铝箔里外双层袋包装猪真皮片，便于医生在手术台上打开内袋使用。附图说明图1为猪真皮片获取保存流程图；图2为脱细胞处理流程图；图3为残留核糖核酸去除流程图；图4为alpha-半乳糖去除流程图；图5为脱细胞异种真皮的保存流程图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了相互排斥的特质和/或步骤以外，均可以以任何方式组合，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换，即，除非特别叙述，每个特征之一系列等效或类似特征中的一个实施例而已。实施例1：参见图1和图2，一种脱细胞异种真皮制备方法，依次包括以下步骤，步骤A：制取猪真皮片。具体操作为清洗成熟大白猪（约克夏猪种）猪背部皮，去毛刀去毛后，以取皮鼓切取厚度为0.25毫米厚的皮片抛弃不用（作用：除去表皮，毛发及毛囊），再用取皮鼓取厚度为0.50-0.75毫米厚真皮片备用。本领域内的技术人员应知，原料不受猪种、猪龄限制，成熟大白猪猪背部皮仅为一种优选方式，优选原因为其取材方便，可取原料多。步骤B：对猪真皮片进行消毒处理。具体操作为将猪真皮片放入无菌瓶中，加入质量分数为0.5%的过氧乙酸消毒液里浸泡40分钟。步骤C：使用磷酸盐缓冲盐水充分清洗消毒后的猪真皮片。具体操作为使用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，每次均在摇床上摇30分钟。步骤D：将猪真皮片与冷冻防护剂充分混合后保存在冻箱中备用。冷冻防护剂为甘油水溶液或多糖，当冷冻防护剂为甘油水溶液时，甘油的体积百分比浓度为20%或大于等于30%；当冷冻防护剂为多糖时，所述冷冻防护剂为葡聚糖凝胶、蔗糖和天然蜂蜜中的一种或者几种。冷冻防护剂的主要作用在于阻止冰晶的生成，避免冰晶生成损害猪真皮内的胶原蛋白。作为优选，步骤D中还可加入乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸的添加可抑制细菌的生长，乙二胺四乙酸与冷冻防护剂的配比优选为每升冷冻防护剂含20毫摩尔乙二胺四乙酸。步骤E：取出冷冻猪真皮片在室温下融化，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。具体操作为使用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，每次均在摇床上摇30分钟。步骤F：加入脱细胞液，将猪真皮片与脱细胞液充分混合以及反应，具体操作为在摇床上混合10小时，所述脱细胞液含有温和洗涤剂。作为一种优选的方式，所述脱细胞液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其PH值为8，每升4-羟乙基哌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：依次包括以下步骤，步骤A：制取猪真皮片；步骤B：对猪真皮片进行消毒处理；步骤C：使用磷酸盐缓冲盐水充分清洗消毒后的猪真皮片；步骤D：将猪真皮片与冷冻防护剂充分混合后保存在冻箱中备用；步骤E：取出冷冻猪真皮片在室温下融化，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片；步骤F：加入脱细胞液，将猪真皮片与脱细胞液充分混合以及反应，所述脱细胞液含有温和洗涤剂；步骤G：吸出脱细胞液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。

【技术特征摘要】
1.一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：依次包括以下步骤，步骤A：制取猪真皮片；步骤B：对猪真皮片进行消毒处理；步骤C：使用磷酸盐缓冲盐水充分清洗消毒后的猪真皮片；步骤D：将猪真皮片与冷冻防护剂充分混合后保存在冻箱中备用；步骤E：取出冷冻猪真皮片在室温下融化，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片；步骤F：加入脱细胞液，将猪真皮片与脱细胞液充分混合以及反应，所述脱细胞液含有温和洗涤剂；步骤G：吸出脱细胞液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。2.根据权利要求1所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：所述冷冻防护剂为甘油水溶液或多糖，当冷冻防护剂为甘油水溶液时，甘油的体积百分比浓度为20%或大于等于30%；当冷冻防护剂为多糖时，所述冷冻防护剂为葡聚糖凝胶、蔗糖和天然蜂蜜中的一种或者几种。3.根据权利要求2所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：所述步骤D中还添加有乙二胺四乙酸。4.根据权利要求1所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：所述脱细胞液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其PH值为8，每升4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液含20毫摩尔4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述温和洗涤剂为十二烷基聚乙二醇醚、乙基苯基聚乙二醇和脱氧胆酸钠中的一种或者几种，当所述温和洗涤剂为脱氧胆酸钠时，脱氧胆酸钠的质量体积百分比溶度为2%。5.根据权利要求4所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：所述脱细胞液中还添加有乙二胺四乙酸。6.根据权利要求1所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：所述脱细胞液体积与猪真皮片体积之比...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷良伟，
申请(专利权)人：江西瑞诺健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36