一种生物羊膜的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生物羊膜的制备方法，通过原料预处理、一系列化学处理、干燥、灭菌，得到生物羊膜。本发明专利技术的生物羊膜的制备方法是通过高渗盐水破坏羊膜细胞结构，再用DNA酶分解细胞破裂后暴露的DNA，在更为彻底的降低免疫原性同时还保留了羊膜的其他组成结构，如蛋白网架，使羊膜在临床使用中更好的发挥效用，同时整个过程中所使用的试剂残留量少、化学性质柔和，不会影响人体健康。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医用生物材料技术，具体地涉及一种生物羊膜的制备方法。
技术介绍
羊膜是指人类胎盘的基底膜层，是无血管、无细胞结构的胶原组织层，富含IV、V型胶原、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子，易使上皮细胞移行长入、促进上皮的分化、增殖，在上皮创伤愈合中起重要作用。羊膜含各种蛋白抑制因子，通过抑制相应蛋白酶而发挥抗炎作用。同时还含有抑制细胞因子表达和调节细胞凋亡成分TGF-β1，可避免胶原纤维过度增生，预防粘连。通过上述机理达到组织修复和眼表重建并防止复发的目的。通过合理的物理处理方法保留羊膜基本的蛋白网架结构，得到生物羊膜。生物羊膜含有丰富的胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等蛋白成分，为创伤愈合提供细胞生长的网架结构同时，也促进人体细胞的分化、分裂，从而达到快速愈合的效果。另外，羊膜中不含有血管、神经、淋巴等组织，使生物羊膜产品在临床使用后几乎不发生免疫排斥反应。此外还有来源广泛、保存简便、手术操作简单等特点，适用于烧伤、普外、眼科、内分泌等科室各类常规手术当中。现有的羊膜处理方法为了降低产品的的免疫原性，多是通过各种有机化学试剂对羊膜进行脱细胞，在这个过程中可能会带来一些负面效应，例如，有机化学试剂残留过多，临床使用后影响愈合和患者健康；在脱细胞过程中，有机化学试剂同时破坏了羊膜的其他结构，如胶原蛋白、胶原纤维等，造成产品薄、韧性差、生物性功能不能满足临床要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生物羊膜的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下内容：一种生物羊膜的制备方法，包括以下步骤：1)原料预处理：将胎盘放入第一溶液中，清除血块，使羊膜和绒毛膜与胎盘分离，并将羊膜和绒毛膜分离，得到预处理羊膜；所述第一溶液为生理盐水；2)化学处理：①在步骤1)得到的预处理羊膜中加入第二溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第二溶液，得到一次处理羊膜；所述第二溶液为3MNaCl溶液；②向一次处理羊膜中加入第三溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第三溶液，重复不少于2次，得到二次处理羊膜；所述第三溶液为灭菌纯化水；③向二次处理羊膜中加入第四溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第四溶液，得到三次处理羊膜；所述第四溶液为去DNA溶液，由0.5MCaCl2、0.5MMgCl2、0.5MHEPES、纯化水按0.2：1：4：195比例混合，加入DNA酶制成0.25mg/mL溶液；④向三次处理羊膜中加入第五溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第五溶液，得到四次处理羊膜；所述第五溶液为pH7.0磷酸盐缓冲溶液；⑤向四次处理羊膜中加入第三溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第三溶液，得到五次处理羊膜；⑤向五次处理羊膜中加入第六溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第六溶液，得到六次处理羊膜；所述第六溶液为70％异丙醇溶液；⑦向六次处理羊膜中加入第三溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第三溶液，重复不少于1次，得到七次处理羊膜；3)将步骤2)得到的七次处理羊膜进行干燥、灭菌，得到生物羊膜。本专利技术在化学处理步骤中，通过严格使用六种溶液配合严格的处理步骤，使得更彻底的降低免疫原性同时还保留了羊膜的其他组成结构，试剂残留量少。进一步地，步骤1)中，胎盘和第一溶液的用量配比为每个胎盘使用500-1000mL第一溶液。进一步地，步骤1)中，在20±5℃温度条件下进行清洗。一般清洗15-30分钟。步骤2)中，各处理步骤均是在无菌瓶中进行，例如Nalgene瓶。轨道式摇床又称为轨道式振荡器，可市售购买获得。为保证各溶液与羊膜充分接触，只能使用轨道式摇床。进一步地，步骤2)中，轨道式摇床的转速为50-100rpm，优选为75rpm。步骤2)①为脱细胞过程，是通过高渗盐水使细胞破裂，从而降低免疫原性。如果去除此步，则无法根本性地降低免疫原性，在临床使用后容易发生免疫排斥反应。进一步地，步骤2)①中，预处理羊膜和第二溶液的用量配比为1g羊膜：5mL第二溶液。步骤2)②主要作为清洗过程，来清除残留的第二溶液和细胞破裂后释放的物质。如果去除此步骤，则经残留的第二溶液、细胞释放物无法清除，会影响后续步骤的效果，同时细胞释放物中含有免疫原性蛋白、DNA等，此步清洗的过程可以降低其免疫原性。多次清洗才能更有效的清除残留等，次数过少可能造成清洗不够彻底。进一步地，步骤2)②中，一次处理羊膜和第三溶液的用量配比为1g一次处理羊膜：10mL第三溶液。步骤2)③主要是对细胞破裂后释放的DNA进行分解，进一步降低免疫原性。进一步地，步骤2)③中，二次处理羊膜和第四溶液的用量配比为1g二次处理羊膜：5mL第四溶液。步骤2)④一方面用来清洗羊膜，去除第四溶液残留；另一方面是使羊膜所含液体的pH值调节到7.0左右，以便促进羊膜结构的稳定。进一步地，步骤2)④中，三次处理羊膜和第五溶液的用量配比为1g三次处理羊膜：10mL第五溶液。步骤2)⑤在使用第五溶液处理后，再使用第三溶液处理一次，进一步去除溶液残留。进一步地，步骤2)⑤中，四次处理羊膜和第三溶液的用量配比为1g三次处理羊膜：10mL第三溶液。此外，在实际生产中，考虑到生产流程时间问题，通常在此步骤时，再将使用第三溶液处理过的五次处理羊膜浸泡在第三溶液中，放入4℃冰箱中保存12-24小时过夜，之后在第二天继续后续的步骤。步骤2)⑥是彻底清洗过程，来去除羊膜中破裂的细胞、DNA分解物和溶液残留。只使用灭菌纯化水无法将各种残留物清洗干净。进一步地，步骤2)⑥中，五次处理羊膜和第六溶液的用量配比为1g四次处理羊膜：10mL第六溶液。步骤2)⑦是再用灭菌纯化水将上一步处理后残留的异丙醇溶液清洗干净。进一步地，步骤2)⑦中，六次处理羊膜和第三溶液的用量配比为1g五次处理羊膜：10mL第三溶液。进一步地，步骤3)中，是在45±1℃干燥30-60min。温度过低，则烘干效果不理想，延长烘干时间；温度过高，则容易将羊膜烘焦。进一步地，步骤3)中，是在机械对流烘箱中干燥。使用机械对流烘箱可以保证温度稳定控制在45±1℃，且羊膜能够均匀受热。本专利技术具有以下优点：本专利技术的生物羊膜的制备方法是通过高渗盐水破坏羊膜细胞结构，再用DNA酶分解细胞破裂后暴露的DNA，在更为彻底的降低免疫原性同时还保留了羊膜的其他组成结构，如蛋白网架，使羊膜在临床使用中更好的发挥效用，同时整个过程中所使用的试剂残留量少、化学性质柔和，不会影响人体健康。具体实施方式为了更清楚地说明本专利技术，下面结合优选实施例对本专利技术做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。实施例一种生物羊膜的制备方法，包括以下步骤：一、预处理新鲜胎盘组织可以在4℃温度条件下冷藏不超过72h。将胎盘从冷藏环境中取出并移入洁净室，在无菌环境下，将胎盘组织以500-1000mL/每个胎盘的量放入装有第一溶液的无菌盆中，将羊膜层和绒毛膜层一起从胎盘上分离下来；将取得的羊膜层和绒毛膜层平放在处理盘上，先确定组织处理适用性，废弃不适用的组织，之后轻揉组织约15-30分钟，从羊膜层上分离绒毛膜层，去除所有可见的血、碎片和绒毛膜，用剪刀将羊膜边缘整理干净，得到预处理羊膜；加入后清洗分离。如经前述步骤后，部分羊膜仍难以分离，则将羊膜本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物羊膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1)原料预处理：将胎盘放入第一溶液中，清除血块，使羊膜和绒毛膜与胎盘分离，并将羊膜和绒毛膜分离，得到预处理羊膜；所述第一溶液为生理盐水；2)化学处理：①在步骤1)得到的预处理羊膜中加入第二溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第二溶液，得到一次处理羊膜；所述第二溶液为3M NaCl溶液；②向一次处理羊膜中加入第三溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第三溶液，重复不少于2次，得到二次处理羊膜；所述第三溶液为灭菌纯化水；③向二次处理羊膜中加入第四溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第四溶液，得到三次处理羊膜；所述第四溶液为去DNA溶液，由0.5M CaCl2、0.5M MgCl2、0.5M HEPES、纯化水按0.2：1：4：195比例混合，加入DNA酶制成0.25mg/mL溶液；④向三次处理羊膜中加入第五溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第五溶液，得到四次处理羊膜；所述第五溶液为pH7.0磷酸盐缓冲溶液；⑤向四次处理羊膜中加入第三溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第三溶液，得到五次处理羊膜；⑥向五次处理羊膜中加入第六溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第六溶液，得到六次处理羊膜；所述第六溶液为70％异丙醇溶液；⑦向六次处理羊膜中加入第三溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第三溶液，重复不少于1次，得到七次处理羊膜；3)将步骤2)得到的七次处理羊膜进行干燥、灭菌，得到生物羊膜。...

【技术特征摘要】
1.一种生物羊膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1)原料预处理：将胎盘放入第一溶液中，清除血块，使羊膜和绒毛膜与胎盘分离，并将羊膜和绒毛膜分离，得到预处理羊膜；所述第一溶液为生理盐水；2)化学处理：①在步骤1)得到的预处理羊膜中加入第二溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第二溶液，得到一次处理羊膜；所述第二溶液为3MNaCl溶液；②向一次处理羊膜中加入第三溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第三溶液，重复不少于2次，得到二次处理羊膜；所述第三溶液为灭菌纯化水；③向二次处理羊膜中加入第四溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第四溶液，得到三次处理羊膜；所述第四溶液为去DNA溶液，由0.5MCaCl2、0.5MMgCl2、0.5MHEPES、纯化水按0.2：1：4：195比例混合，加入DNA酶制成0.25mg/mL溶液；④向三次处理羊膜中加入第五溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第五溶液，得到四次处理羊膜；所述第五溶液为pH7.0磷酸盐缓冲溶液；⑤向四次处理羊膜中加入第三溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第三溶液，得到五次处理羊膜；⑥向五次处理羊膜中加入第六溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第六溶液，得到六次处理羊膜；所述第六溶液为70％异丙醇溶液；⑦向六次处理羊膜中加入第三溶液，在轨道式摇床处理一段时间，去掉第三溶液，重复不少于1次，得到七次处理羊膜；3)将步骤2)得到的七次处理羊膜进行干燥、灭菌，得到生物羊膜。2.根据权利要求1所述的一种生物羊膜的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷良伟，
申请(专利权)人：江西瑞诺健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36