本发明专利技术是关于一种以免疫活性肽为载体的分支多肽及其衍生物与应用。该分支多肽自氨基端到羧基端的结构式为(AAN)4-(Lys)2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg；AAN为甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区，羧基端序列Thr-Lys-Pro-Arg为免疫活性肽Tuftsin。甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区自氨基端到羧基端的序列为Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp。本发明专利技术的分支多肽可制备成流感疫苗。本发明专利技术的分支多肽能与M2多克隆抗体特异性结合，能与巨噬细胞特异结合，促进抗原呈递细胞的处理。本发明专利技术的分支多肽制备的疫苗诱导动物免疫应答效率高，并能保护动物免受病毒感染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种以免疫活性肽为载体的分支多肽及其衍生物与应用，特别是涉及一种具有流感病毒免疫原性的分支多肽。
技术介绍
RNA病毒的高变异能力对生产针对这类病毒感染的疫苗是极大的挑战，这些病毒主要包括流感病毒、HIV和HCV等。由不同型别流感病毒引起的流感大流行时刻威胁着全球，而现有流感疫苗的保护效果受到疫苗毒株与实际流行株的匹配程度的制约。所以为了研制对甲型流感病毒各种亚型或突变株都有效的通用疫苗，人们将目光投向了流感病毒较为保守的核蛋白(NP)和基质蛋白 2(M2) (GS Jimenez, R Planchon, Q Wei，HumVaccin, 3(5) :157-64,2007 ；M Schotsaert, M De Filette, W Fiers, Expert RevVaccines,8(4) 499-508,2009)。抗病毒疫苗的保护效果除了与针对的病毒蛋白有关，还与疫苗的类型有关。合成肽疫苗，尤其是筛选病毒的抗原表位并采用人工合成方法制成的表位肽疫苗具有很多优点可避免不利于免疫应答的表位而选择有利于免疫应答的表位，在保持抗原特异性的基础上诱导免疫应答；可用化学合成的方法制备，研发时间短、工艺简单并且制备过程安全， 获得病毒抗原序列信息后可很快完成制备过程，因此适宜应对新发、突发传染病。但抗原表位多是短肽，分子量小，抗原性和免疫原性都很弱，必须进行加工改造才能发挥疫苗的作用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种分支多肽及其衍生物与应用，目的之一是提供一种免疫原性高的分支多肽。本专利技术所提供的分支多肽自氨基端到羧基端的结构式为(AAn)4-(Lys)2-Lys-Thr-Lys-Pr0-Arg,上述分支多肽的羧基端序列 Thr-Lys-Pro-Arg为免疫活性肽Tuftsin。所述AAn为甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区。 将上述分支多肽命名为分支状(iCe)4-TuftSin。其中，所述甲型流感病毒的基质蛋白2胞外区自氨基端到羧基端的序列为Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-C ys-Asn—Asp-Ser—Ser—Asp。可在所述的分支多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、 羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化，得到所述分支多肽衍生物。所述的分支多肽可以与酸或碱反应形成药学上可接受的盐类化合物。对本专利技术的分支多肽可进行等同变化获得如下的分支多肽(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 8_ (Lys) 4_ (Lys) 2-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg ；(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 2~Ly s-Thr-Ly s-Pro-Arg ο本专利技术的另一个目的是提供所述分支多肽及其衍生物的应用。所述分支多肽及其衍生物可制备成流感疫苗。所述的流感疫苗，其活性物质为所述的分支多肽或所述分支多肽的衍生物。所述流感疫苗中还含有佐剂，佐剂能够增强对疫苗组分抗原特异性免疫应答或改变免疫反应。佐剂可以选用多种，如Al (OH)3佐剂。上述流感疫苗为甲型流感病毒疫苗。所述甲型流感病毒包括Hmi流感病毒、H2N2流感病毒、H3N2流感病毒、H5W流感病毒、H7N7流感病毒和H9N2流感病毒等。本专利技术的分支多肽能与M2多克隆抗体特异性结合，能与巨噬细胞特异结合，提高了抗原呈递细胞的工作效率。本专利技术的分支多肽制备的疫苗诱导动物的免疫应答效率高，并能保护动物免受病毒感染。本专利技术的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。 附图说明图1为分支状(iCe)4-TuftSin结构示意图。图2为分支状(iCe)4_Tuftsin HPLC分析结果。图3为分支状(Mk) 4-Tuftsin质谱分析结果。图4为分支状(Mk)4-Tuftsin SDS-PAGE分析结果，图中1代表分支状 (M2e) 4-Tuftsin ；2 代表分支状(M2e)4-G40图5为分支状(Mk) 4-Tuftsin Western-blot检测结果，图中1为分支状 (M2e) 4-Tuftsin ；2 为分支状(M2e)4-G40图6为ELISA检测免疫小鼠血清中Mk抗体效价。图7为ELISpot检测免疫小鼠脾细胞的结果。图8为流感病毒攻击后不同免疫组小鼠存活率。图9为分支状(iCe)8_Tuftsin结构示意图.图10为ELISA检测分支状(Mk) 8-Tuftsin抗原性结果。图11为FITC标记分支状(iCe)8_Tuftsin与巨噬细胞结合结果0OOX)。图12为实施例2ELISA检测小鼠血清Mk抗体效价。图13为实施例2ELISpot实验结果。图14为实施例2小鼠肺病毒载量的检测结果。具体实施例方式实施例11)合成分支状多肽使用多肽合成仪，采取固相合成法合成图1所示的四分支多肽(Mk)4-Tuftsin， 该分支状多肽从N端到C端的结构式为(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Cys-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp) 4- (Lys) 2-Lys-Thr-LyS-Pro-Arg0对上述合成的分支状多肽进行高效液相和质谱分析，以及SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳和ffestern-blot分析。图2至图5所示结果表明，多肽合成仪合成的多肽为我们所设计的分支状多肽，将其命名为分支状(M&)4-TUftSin，其分子量为11312Da。2)分支状多肽的抗原性鉴定采用ELISA的方法测定分支状(Mk) 4-Tuftsin与M2多克隆抗体特异性识别和结合的能力，具体方法如下将浓度0. 0625 μ g、0. 125 μ g、0. 25 μ g、0. 5 μ g 禾口 1 μ g 的分支状(M2e) 4-Tuftsin 分别包被到ELISA板的孔内，以大肠杆菌表达的重组禽流感病毒M2蛋白作为阳性对照。以小鼠抗M2多克隆抗体作为一抗，二抗为碱性磷酸酶标记羊抗小鼠免疫球蛋白IgG抗体。ELISA结果显示示，分支状(Mk) 4-Tuftsin能与抗M2多克隆抗体特异性识别和结合，当分支状(Mk) 4-Tuftsin包被量在0. 0625 μ g/孔至0. 25 μ g/孔范围时，吸光度值与其成正比；而分支状(Mk) 4-Tuftsin量在0. 25 μ g/孔至1 μ g/孔时，吸光度值达到平台期。说明分支状(M&)4-TUftSin具有甲型流感病毒M2抗原活性。3)分支状多肽与巨噬细胞结合试验使用多肽合成仪，采取固相合成法合成对照分支肽(Mk) 4-G4，用四个甘氨酸取代了 Tuftsin。分支肽(M2e)4-G4 从 N 端到 C 端的结构式为(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种分支多肽，其特征在于：所述分支多肽自氨基端到羧基端的结构式如下；（ＡＡＮ）８－（Ｌｙｓ）４－（Ｌｙｓ）２－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ；或（ＡＡＮ）４－（Ｌｙｓ）２－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ；所述ＡＡＮ为甲型流感病毒的基质蛋白２胞外区，上述分支多肽的羧基端序列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ为免疫活性肽Ｔｕｆｔｓｉｎ。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张智清，刘晓宇，郭建强，徐一，韩苏，姚立红，陈爱珺，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，元森泰生物科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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