本发明专利技术公开了一种抗乙酰胆碱受体单链抗体靶向补体调节因子CD55的融合蛋白scFv-CD55。其目的是通过单链抗体将CD55靶向到神经肌接头处抑制致病性乙酰胆碱受体自身抗体与乙酰胆碱受体结合及阻断补体的级联反应，保护乙酰胆碱受体和消除补体系统激活引起的免疫损伤，从而靶向治疗重症肌无力。ScFv-CD55是通过(G4S1)3连接肽在补体调节因子CD55(SCR1-4)的氨基端偶联抗乙酰胆碱受体单链抗体得到的融合蛋白。利用基因工程手段通过原核表达及纯化后获得可溶性scFv-CD55。实验表明，融合蛋白scFv-CD55不仅保留了scFv的乙酰胆碱受体亲和力以及CD55的补体抑制功能，而且在细胞水平的试验中显著提高其补体抑制功能，减少免疫损害部位的补体沉积。此发明专利技术开发一种新的治疗重症肌无力的生物制剂，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药生物
，具体涉及基因克隆、外源基因在原核系统的中的 表达、蛋白纯化、包涵体复性、乙酰胆碱受体特异性单链抗体与补体调节因子(DAF)融合蛋 白(scFv-DAF)的体外活性测定及其细胞水平的补体攻击保护试验。目的在于研制开发一 种新的治疗重症肌无力的生物制剂scFv-DAF，可以通过抑制重症肌无力患者体内的病理性 致病因子-乙酰胆碱受体自身抗体与乙酰胆碱受体结合及补体系统的激活，保护乙酰胆碱 受体和消除补体系统激活引起的免疫损伤从而治疗重症肌无力。具有重要应用前景和意 义。2.
技术介绍
重症肌无力(MG)是一种严重危害患者身心健康的最典型的自身免疫性疾病之 一，它有明确的抗原、抗体及病理作用靶点-神经肌肉接头(NMJ)，是研究其它自身免疫性 疾病发病机制和治疗的最理想的模型之一。虽然，目前重症肌无力患者的治疗采用胆碱酯 酶抑制剂、免疫调节或抑制剂及胸腺摘除等，但疗效均不理想。以往重症肌无力的治疗研究 多集中于患者体内的病理性致病因子-乙酰胆碱受体抗体，T细胞、免疫疫苗、炎性细胞因 子、B细胞等，而在重症肌无力发病过程中起重要作用的补体/补体调节因子的作用则没有 引起足够重视。重症肌无力患者和重症肌无力动物模型体内的病理性致病因子-乙酰胆碱 受体抗体和神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体结合，激活大量的补体并沉积于神经肌肉接头 处溶解、破坏突触后膜和乙酰胆碱受体，致神经肌肉接头处传递障碍，出现肌肉收缩无力。 目前，大量资料表明补体系统激活引起的神经肌肉接头免疫损伤，在重症肌无力发病过程 中起非常重要的作用。单链抗体(scFv)是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)经连接链连接而 成。单链抗体是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位，因其相对分子质 量小、穿透力强、免疫原性低而备受关注。乙酰胆碱受体单链抗体具有以下特点(1)结构 上是由抗体重链可变区(VH)-连接链(G4S1)3-轻链可变区(VL)构成，是没有Fc段的单价 抗体，其大小是抗体全长的六分之一 ；O)乙酰胆碱受体单链抗体只有1个抗原结合位价， 只能与乙酰胆碱受体上两个α-亚单位中的一个主要免疫原区结合，不会引起乙酰胆碱受 体分子之间的交联导致的抗原调变；(3)此外，乙酰胆碱受体单链抗体没有Fc段，所以不能 激活补体，从而避免了补体系统激活而引起的免疫损伤；(4)乙酰胆碱受体单链抗体能够 特异性的与乙酰胆碱受体结合，封闭、阻断重症肌无力患者体内致病因子-乙酰胆碱受体 抗体与乙酰胆碱受体结合，一方面保护乙酰胆碱受体免受重症肌无力患者体内致病性乙酰 胆碱受体抗体的攻击，另一方面，这一特性使得单链抗体成为理想的靶向工具；补体系统的激活为一种级联反应，但受到多种调节分子的严格控制，其反应的程 度和单一成分的反应都是在生物反馈控制下而进行的，从而限制了活化的扩大化，以维持 补体水平的平衡。由于补体调节系统的失衡与炎症、肿瘤、自身免疫疾病、异种器官移植、缺 血再灌注损伤及年龄相关性的关节炎，早老性痴呆、骨质疏松症等诸多的病理生理过程相关，因此补体调节因子被广泛的用于上述领域。补体调节蛋白可以分为可溶性和膜表面补 体调节蛋白两大类，其中膜补体调节蛋白是一类能够抑制补体激活的膜分子。人类的膜补 体调节蛋白包括⑶55 (DAF促衰变因子)、⑶59、⑶46 (MCP膜表面协同因子蛋白)、⑶35 (CRl 补体受体1)。补体调节因子的功能是调节/抑制补体系统的激活，广泛分布于哺乳动物组 织细胞膜表面保护宿主组织细胞免受补体系统激活引起的免疫损伤。DAF为通过磷脂酰肌 醇(GPI)锚定于细胞膜表面的糖蛋白，分子量约为70kD。DAF由补体调节区和锚定区组成， 根据功能区的氨基酸序列可以把功能区分为四个短的重复序列(SCR1-4)，锚定区含有较多 的丝氨酸/苏氨酸(S/T)并且高度糖基化，羧基末端的GPI将DAF锚定在细胞膜脂质双层 结构的外层。补体调节因子DAF可以抑制补体激活的经典和旁路通路。DAF作用于补体C3 和C5转换酶，可同C2竞争与C4b结合，从而抑制C3转化酶合成，并促进其分解；加速旁补 体激活通路中的C3转化酶(C3bBb)中恥的解离。补体系统的激活起始于抗体与膜表面抗 原结合，形成膜攻击复合物(MAC)，引起组织细胞损伤。正常机体组织内补体/补体调节因 子处于平衡状态，补体并不能引起组织细胞损伤。当机体长期处于异常免疫应答或严重免 疫反应或在某些疾病状态下，两者之间失去了动态平衡，补体系统被激活并沉积于相应组 织细胞表面引起免疫损伤。补体调节因子与抗体介导并有补体参与的许多自身免疫性疾病 的发病过程密切相关，最有代表性的是阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)，患者的造血细胞补体 调节分子的膜锚定分子编码基因PIG-A异常，导致细胞表面的补体调节分子锚定异常，导 致全血细胞降低，较易观察到的是红细胞溶血导致的血红蛋白尿。在重症肌无力发病过程 中大量的补体被激活并沉积于神经肌接头处，引起神经肌接头病理损害，出现肌无力症状。 疾病模型进一步证明敲除DAF基因的大鼠更易于受到抗乙酰胆碱受体抗体攻击而发生肌 无力症状。我们以往的研究表明，补体调节因子DAF集中分布于小鼠神经肌接头突触后膜。 激光共聚焦显微镜进一步证实DAF和乙酰胆碱受体共存于小鼠神经肌接头突触后膜。另 外，我们用实时定量RT-PCR检测DAF，发现在重症肌无力动物模型眼外肌DAF基因表达明显 减少。综上所述，神经肌接头处的补体调节因子DAF是定点靶向治疗重症肌无力的重要环 节之一。因此，若将乙酰胆碱受体单链抗体与补体调节因子DAF偶联，形成复合体，将其靶 向引导到重症肌无力患者或者动物模型神经肌接头处，则有可能保护乙酰胆碱受体，同时 有效抑制补体系统的激活，阻断补体系统激活引起的免疫损伤。3.
技术实现思路
综上所述，本专利技术的目的在于，提供能够特异性结合乙酰胆碱受体的单链抗体与 补体调节因子(DAF)融合蛋白及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是特异性结合乙酰胆碱受体的单链 抗体与补体调节因子(DAF)融合蛋白是通过在基因水平用(G4S1)3在补体调节因子DAF的 氨基端连接抗乙酰胆碱受体单链抗体scFv得到的融合基因克隆到原核表达载体pET16b中 用原核系统表达融合蛋白并对所得到的蛋白产物进一步纯化，通过包涵体复性得到可溶的 具有生物学活性的蛋白并在体外检测其各组分功能。本专利技术提供了一种能够特异性结合乙酰胆碱受体的单链抗体靶向补体抑制因子 scFv-DAF。此融合蛋白是以重症肌无力自身抗体的攻击目标AChR作为靶点，用针对AChR 的单链抗体作为“载体”而促衰变因子DAF作为效应分子的特异性针对重症肌无力补体激活位点的靶向补体抑制因子。这种融合蛋白不仅具有特定疾病病理性补体激活部位的靶向 作用，还可以对局部的补体攻击具有保护作用。一方面可以达到抑制补体激活的治疗补体 相关疾病的作用；另一方面，由于scFv “导向弹头”的作用，可以显著减少用药剂量，避免全 身性补体抑制的副作用。试验结果表明，scFv-DAF保留了其两个不同组分各自的功能，并且 可以特异性与TE671细胞表面的靶点AChR相结合，减少细胞表面免疫沉淀的数量和程度。 因此可以本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种乙酰胆碱特异性结合的单链抗体与补体抑制因子（ＤＡＦ）的融合蛋白，其特征在于，应用分子克隆技术通过连接链（Ｇ４Ｓ１）３将乙酰胆碱特异性结合的单链抗体与补体抑制因子（ＤＡＦ ＳＣＲ１－４）在基因水平偶联，构建所得的融合蛋白在原核表达系统中高效表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李柱一，宋琛，徐志凯，徐江，林宏，宿长军，苗建亭，李宏增，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87
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