一种肝细胞凋亡动物模型的建立方法与应用技术

本发明专利技术涉及D-氨基半乳糖胺和脂多糖联合诱导的肝细胞凋亡动物疾病模型的制备方法，特别是一种简单的诱导剂配方及简单的操作程序，产生80％以上的肝细胞凋亡率，复制出稳定、可靠的肝细胞凋亡动物模型及其在肝炎发病机制的研究和新型抗肝炎药物评价中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种动物疾病模型的制备方法，特别是一种简单的诱导剂配方及简单 的操作程序，产生80%以上的肝细胞凋亡率，复制出稳定、可靠的肝细胞凋亡动物模型及其 在肝炎发病机制的研究和新型抗肝炎药物评价中的应用。
技术介绍
肝炎是肝脏发生炎性病变的总称，根据病因可分为病毒性、酒精性、药源性和自身 免疫性肝炎等，以病毒性肝炎为多见，其中以乙型肝炎为主，丙型肝炎次之。乙型肝炎是由 乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种危害极大的世界性流行的传染病，据统计目前全世界约有 3. 5亿HBV携带者，而中国是HBV高感染地区，HBV携带者占总人口的10% 15%，其中慢性 乙肝患者约3000万例，每年约有35万人死于慢性乙肝相关疾病。1990年起我国开展的新 生儿疫苗接种虽然显著降低了儿童慢性乙肝感染率，但并未遏止乙肝发病率的上升趋势， 乙肝及其相关疾病仍是我国重要的公共卫生问题。由于乙肝的发病机理(包括病毒感染及 肝细胞死亡)尚不十分清楚，致使乙肝治疗至今尚无安全有效的药物和根治办法。因此，深 入研究肝炎的发病及转归机制，继续研制安全有效的抗乙肝创新药物及治疗方法仍是当务 之急。现有的肝炎治疗策略主要是通过抑制病毒复制、提高机体免疫功能和改善肝细胞代 谢来减轻肝脏损伤。近年来研究发现肝细胞过度凋亡与各型肝炎尤其是病毒性肝炎关系十 分密切，在病毒性肝炎慢性化和肝细胞癌变中起着重要作用。调控肝细胞凋亡，减轻肝脏 炎症反应和病理损伤程度，被认为是极具前景的肝炎治疗的新途径。而对肝炎发病机制的 探讨和潜在治疗药物的筛选及评价，在很大程度上依赖于疾病相关的体内外模型的建立及 应用。但至今仍缺乏稳定、可靠的肝细胞凋亡模型可用，给肝炎治疗策略的拓展和新型抗肝 炎药物的开发造成了极大的困难。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种用肝毒物配方诱导，适用于常规实验动物， 简单易行，产生80%以上的肝细胞凋亡率、稳定、敏感性高的肝细胞凋亡动物模型，而且耗 费人力财力少，实验周期短，成模率高，适用于肝炎发病机制的研究和抑制肝细胞凋亡药物 的评价，为肝炎治疗策略的拓展和新型抗肝炎药物的开发提供一种稳定、可靠的肝细胞凋 亡模型。为此，本专利技术采取以下技术方案一种简单易行，能产生80%以上的肝细胞凋亡率，稳定、可靠，而且耗费人力财力 少，实验周期短即可获得肝细胞凋亡动物模型的建立方法。肝细胞凋亡动物模型的建立无 需特殊装置，易于开展。建立的肝细胞凋亡模型可以很好的模拟各种肝炎尤其是病毒性肝 炎的肝细胞损伤凋亡机制。利用该模型深入研究肝炎的发病机制并开发抑制肝细胞凋亡的 药物，在疾病的早期对凋亡进行调控，可显著减轻肝脏炎症反应和病理损伤程度，将会对肝 炎的治疗提供新的方向。现有的肝细胞凋亡模型不稳定、成模率低，没有明确的评价指标和标准，未进行综合的、系统地评价，不成熟。而用本专利技术得到的肝细胞凋亡动物模型肝细胞凋亡率可达到 80%以上，且得到的疾病模型稳定可靠、简单方便、周期短、成本低。一种用D-氨基半乳糖胺和脂多糖诱导，简单易行，能产生80%以上的肝细胞凋亡 率，稳定可靠，而且耗费人力财力少，实验周期短的肝细胞凋亡动物模型的建立方法。具体 制备方法如下取18 22克的ICR小鼠，通过腹腔注射D-氨基半乳糖胺(750mg/kg)和脂多糖 (8mg/kg)，注射后8小时，即可用于肝炎发病机制研究和抗凋亡药物开发。本专利技术与现有技术相比具有如下优点(1)用D-氨基半乳糖胺和脂多糖诱导，简 单易行，能产生80%以上的肝细胞凋亡率，稳定可靠的肝细胞凋亡动物模型；( 耗费人力 财力少，实验周期短，成模率高；(3)适于肝炎发病机制研究和抑制凋亡药物评价；(4)与肝 炎尤其是病毒性肝炎肝细胞损伤凋亡具有良好的相关性。四附图说明图1-3为实施例1所得到的肝细胞凋亡的DNA电泳分析、组织病理学分析、脱氧核 糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)分析结果。图1为实施例1所得到的小鼠肝细胞凋亡病理组织学分析结果 图2为实施例1所得到的小鼠肝细胞凋亡DNA电泳分析结果 图3为实施例1所得到的小鼠肝细胞凋亡TUNEL染色分析结果五具体实施例方式实施例1 肝细胞凋亡小鼠模型的制备及评价1准备以下材料1. 1实验动物ICR小鼠由浙江省实验动物中心提供。1. 2D-氨基半乳糖胺嘉兴恒杰生物工程有限公司产品。1. 3脂多糖美国SIGMA公司产品。1. 4细胞凋亡DNALadder检测试剂盒南京凯基生物科技发展有限公司。1. 5细胞凋亡荧光HoeChst33342/PI双染试剂盒南京凯基生物科技发展有限公司。1.6 In Situ Cell Death Detection Kit, POD =Roche Kit2制备方法按如下步骤2. 1实验前小鼠先适应性饲养3天。2. 2用生理盐水按筛选确定的配方比例配制凋亡诱导剂D-氨基半乳糖胺和脂多 糖溶液。2. 3动物称重编号后，按配方剂量给腹腔注射凋亡诱导剂。2. 4诱导剂注射后8小时，即可形成典型的肝细胞凋亡模型。2. 5肝细胞凋亡的DNA电泳分析评价脱颈椎处死小鼠，取肝组织用PBS buffer 洗去血污；称取组织少量放到勻浆器勻浆；勻浆好后用PBS buffer冲洗并倒入一个1. 5ml 的离心管中，然后按试剂盒操作常规抽提DNA ；抽提DNA用1. 5%琼脂糖凝胶电泳呈梯形条市ο2. 6肝细胞凋亡的综合验证采用TUNEL法、病理组织学分析、流式细胞术和电镜分析综合评价与验证。实施例2 抗凋亡药物评价1准备以下材料1. 1实验动物ICR小鼠由浙江省实验动物中心提供。1. 2D-氨基半乳糖胺嘉兴恒杰生物工程有限公司产品。1. 3试验药液(用生理盐水稀释)1. 4脂多糖美国SIGMA公司产品。1. 5细胞凋亡DNA Ladder检测试剂盒南京凯基生物科技发展有限公司。2评价方法按如下步骤2. IICR小鼠动物随机分为大中小三个剂量组和溶剂对照组，每组10只小鼠。2. 2造模前三天预防给药，每天1次；造模后再给药1次，末次给药后4小时，处死 小鼠，取血清用ELISA法测Caspase-3活性，取肝组织作DNA电泳检测或TUNEL法分析。2. 3根据预试验和实际需要，设计试验样品的浓度梯度。2. 4根据DNA电泳作定性分析，通过Caspase-3活性和TUNEL法检测作定量分析， 判断对肝细胞凋亡的抑制程度。权利要求1.一种肝细胞凋亡动物模型的建立方法，包括凋亡诱导剂配方的筛选、凋亡评价指标 的选择、凋亡最佳诱导时间的确定以及模型评价标准的建立等方法与步骤，其特征在于采 用一种简单的诱导剂配方及简单的操作程序，产生80%以上的肝细胞凋亡率，复制出稳定、 可靠的肝细胞凋亡动物模型及其在肝炎发病机制的研究和新型抗肝炎药物评价中的应用。2.根据权利要求1所述的肝细胞凋亡动物模型的建立方法，其特征在于所述的动物为 小鼠，尤其是ICR小鼠。3.根据权利要求1所述的肝细胞凋亡动物模型的建立方法，其特征在于所述的凋亡诱 导剂配方的最佳比例为D-氨基半乳糖胺(750mg/kg)和脂多糖(8mg/kg)。4.根据权利要求1或2所述的肝细胞凋亡动物模型的建立方法，其特征在于所述的凋 亡诱导剂的给药途径为腹腔注射。5.根据权利要求1-5所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种肝细胞凋亡动物模型的建立方法，包括凋亡诱导剂配方的筛选、凋亡评价指标的选择、凋亡最佳诱导时间的确定以及模型评价标准的建立等方法与步骤，其特征在于采用一种简单的诱导剂配方及简单的操作程序，产生８０％以上的肝细胞凋亡率，复制出稳定、可靠的肝细胞凋亡动物模型及其在肝炎发病机制的研究和新型抗肝炎药物评价中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡少青，伍义行，郝冰洁，姜威，张虹莉，贾袁媛，
申请(专利权)人：伍义行，
类型：发明
国别省市：86