本发明专利技术公开了一种定点突变的嗜热菌(Thermoplasma?acidophilum)F3因子重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；是由嗜热菌F3因子重组蛋白基因全长片段通过定点突变(E101Q，N261T)后连接到改造后的表达载体pGL01中，热击法转化大肠杆菌BL21(DE3)，经过异丙基硫代半乳糖苷诱导高效表达后，分离纯化制得。本发明专利技术的重组蛋白具有与人氨肽酶活性位点一致的蛋白活性位点，酶活性好且具有较高的热稳定性，可以利用其评价新合成的氨肽酶抑制剂的抑制效果，替代市售APN进行合成化合物抑制活性筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及活性位点突变的嗜热菌(Thermoplasma acidophilum) F3因子重组蛋白及其在抗肿瘤药物筛选中的应用。
技术介绍
氨肽酶N(APN，⑶13，EC3. 4. 11. 2)是一族II型膜结合糖蛋白，由976个氨基酸组成，分子量约为150KD，属于锌离子依赖性金属蛋白酶和氨肽酶Ml家族的Gluzincins亚族， 以同源二聚体的形式存在于细胞膜。肿瘤细胞生物学研究表明氨肽酶N(Aminc)P印tidas N， APN/CD13)与恶性肿瘤的浸润与转移的发生和发展密切相关。因此以APN为靶点的靶向性抗肿瘤药物研究倍受关注。有关小分子APN抑制剂的天然产物和合成抑制剂，研究较为成熟，其中第一个从网状橄榄链霉菌培养液中发现APN抑制剂Bestatin (通用名为WDenimex) 已作为免疫增强剂于1987年在日本上市。近年来又发现了多种和Bestatin结构类似的小分子化合物，如=Probestin,Actinonin等。因而寻找高效特异性的APN抑制剂成为目前研究中的热点。而开发高效抑制剂的前提是要找到合适的药物靶点。目前在APN的药物筛选中所采用的商品化靶点多为猪的氨肽酶。其表达采用的是真核细胞表达，因此商品化的氨肽酶具有生产成本高，产量低的缺点。另外，商品化的氨肽酶稳定性比较差，不宜长期保存，也造成了药物筛选成本的提高。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供了一种活性位点突变的嗜热菌 (Thermoplasma acidophilum)F3因子重组蛋白及其在抗肿瘤药物筛选中的应用。本专利技术所述活性位点突变的嗜热菌(Thermoplasma acidophilum)F3因子重组蛋白是通过定点突变的方法将F3因子活性位点改造成为人体APN活性位点，通过大肠杆菌原核高效表达后，利用亲和层析，离子交换层析，分子筛层析等一系列纯化手段，最终获得。实验证实本专利技术方法获得的高纯度热稳定性好而且更廉价的重组F3因子蛋白，为抗癌药物的筛选提供更合适的作用靶点。本专利技术所述定点突变的嗜热菌(Thermoplasma acidophilum)F3因子重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示；是由嗜热菌(Thermoplasma acidophilum)F3因子全长基因的301位和782位基因突变获得(g301c，a782c)，突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。其中上述重组蛋白具有与人氨肽酶活性位点一致的蛋白活性位点，且具有在 50°C金属浴中放置150min依然保持酶活的热稳定性。上述重组蛋白最适反应温度为75°C。本专利技术所述定点突变的嗜热菌(Thermoplasma acidophilum)F3因子重组蛋白具体获得的方法是首先对商品化的PET-Mb载体的多克隆位点进行改造，删除掉多余的酶切位点，保留BamHI，XhoI, Ecoll，HindIII酶切位点，并在其中加入了 Prescission 酶切位点，获得PGLOl载体。利用基因定点突变的方法获得301位，782位突变的嗜热3菌F3因子基因(g301a，a782c)。将该基因连接到pGLOl载体上构建成质粒，并转化到大肠杆菌BL21DE(3)中进行原核表达。然后通过镍柱亲和层析，Source-Q离子交换层析，Superdex-200分子筛层析的方法分离获得高纯度的101位和261位突变的嗜热菌 (Thermoplasma acidophilum)F3 因子重组蛋白(E101Q，拟61T)。本专利技术所述定点突变的嗜热菌(Thermoplasma aCidophilum)F3因子重组蛋白在抗癌药物筛选中的应用。其中所述应用是利用定点突变的嗜热菌(Thermoplasma acidophil·)F3因子重组蛋白评价新合成的氨肽酶抑制剂的抑制效果。具体方法是96孔细胞培养板中加入定点突变的嗜热菌(Thermoplasma aCid0philum)F3因子重组蛋白、反应底物(L-亮氨酰-ρ-硝基苯胺)以及不同梯度的氨肽酶抑制剂，37°C孵育0. ！。F3因子与底物相互作用，产生405nm有光吸收的对硝基苯胺， 加入氨肽酶抑制剂后，抑制剂会抑制突变F3因子重组蛋白的活性，影响产物对硝基苯胺的量，从而使405nm的光吸收值降低。按照如下公式计算抑制率抑制率(%) =1鎮吸收度-100%吸收度一空白吸收度根据氨肽酶抑制剂的各个浓度对应相应的抑制率，利用0rigin7. 5软件拟合曲线，计算氨肽酶抑制剂对突变F3因子的IC5tl，评价抑制效果从而对抑制剂进行筛选。上述氨肽酶抑制剂优选Bestatin，LYP, D24或A6。本专利技术设计了独特的嗜热菌F3因子突变基因，使101位谷氨酸突变成谷氨酰胺，261位天冬酰氨突变成苏氨酸，活性位点与人体APN活性位点一致。通过大肠杆菌 BL21 (DE3)进行原核表达，获得了高纯度，高表达量的F3因子重组蛋白。通过对该蛋白的最适反应温度和温度的稳定性测定发现该蛋白具有较强的热稳定性，常温下不易失活。通过 Bestatin, LYP, D24，A6四种氨肽酶阳性抑制剂对突变F3因子重组蛋白与商品化氨肽酶抑制率比较，发现四种抑制剂对两者具有相同的抑制趋势，从而证明了突变F3因子重组蛋白可以替代商品化的氨肽酶在抑制剂筛选中的应用。本专利技术所述的定点突变的嗜热菌(Thermoplasma aCidophilum)F3因子重组蛋白 (E101Q, N261T)制备方法简便，产量大，纯度高；实验证实热稳定性好，与商品酶具有相同的抑制趋势，可以替代商品酶在抑制剂筛选中的作用，具有广阔的应用前景。附图说明图1是PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果。其中M 代表 Marker (从上至下分子量依次为5000bp，3000bp，2000bp，10000bp, 750bp，500bp, 250bp)，F3 为目的条带。图2为纯化后重组F3因子SDS-PAGE电泳图。其中M代表蛋白Marker (从上至下分子量依次为99KD，66KD，51KD，!34KD，23KD)。图3为重组F3因子酶活最适反应温度曲线。结果表明，75°C测定酶活最高。而商品化的APN酶活是在37°C下活性最高。图4为重组F3因子酶活稳定性实验结果。结果表明APN的热稳定性较好，在50°C金属浴中放置150min依然保持酶活。图5为重组F3因子酶活最适反应pH曲线。结果表明最适反应pH为5. 5。图6为Bestatin，LYP, D24，A6四种阳性药物与重组F3因子和商品化APN抑制率实验结果的比较。结果表明，阳性药对重组嗜热菌F3因子的抑制率与商品化APN —致。 具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术的内容作进一步阐述，但本专利技术保护内容并不仅局限于此。实施例1 克隆得到嗜热菌Thermoplasma acidophilum F3因子的突变基因依据NCBI上公开的Thermoplasma acidophilum F3因子全长核苷酸序列设计引物，具体如下表所示引物名称_上游引物_下游引物_Factor F3-全长 cat gtc cat atg gaa gtc gag aag tea ctc本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种定点突变的嗜热菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）Ｆ３因子重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所示；是由嗜热菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）Ｆ３因子全长基因的３０１位和７８２位基因突变获得（ｇ３０１ｃ，ａ７８２ｃ），突变后的核苷酸序列如ＳＥＱＩＤ ＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
1.一种定点突变的嗜热菌(Thermoplasma acidophilum)F3因子重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；是由嗜热菌(Thermoplasma acidophilum)F3因子全长基因的301位和782位基因突变获得(g301c，a782c)，突变后的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。2.如权利要求1所述的定点突变的嗜热菌(Thermoplasmaacidophilum)F3因子重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白具有与人氨肽酶活性位点一致的蛋白活性位点，...
【专利技术属性】
技术研发人员：谷立川，许素娟，苏静，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88
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