本发明专利技术公开了一种聚乙二醇化葡激酶突变体，是将野生型葡激酶的71-87位氨基酸序列之中的任一亲水性氨基酸进行定点突变，将其替换为半胱氨酸，在大肠杆菌高效表达，色谱层析纯化出葡激酶突变体，然后使用甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体中的半胱氨酸进行定点修饰，得到的聚乙二醇化葡激酶突变体。所制备的聚乙二醇化葡激酶突变体的免疫原性显著下降，体内血浆半衰期显著延长，药效更持久，溶解血栓的纤溶活性基本得到保留，可以作为血栓栓塞性疾病的溶栓治疗药物使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种聚乙二醇化的葡激酶突变体及其制备方法和应用，属于生命科学
技术介绍
天然葡激酶(staphylokinase，Sak)是来源于金黄色葡萄球菌的一种蛋白质，由 136个氨基酸组成。Sak是一“间接型”纤溶酶原激活剂，它不能直接使纤溶酶原(Plg)转变为纤溶酶(plasmin，Plm)，而是先与纤溶酶原按1 1比例结合形成无活性的复合物 Sak *plg，在少量纤溶酶启动下，纤溶酶原活性部位暴露，由单链变为双链的纤溶酶，形成活性Sak-plm复合物，后者进一步激活纤溶酶原分子，使之转变为纤溶酶，纤溶酶溶解血栓基质纤维蛋白从而溶解血栓。在血浆中，Sak · plm很快被α 2-抗纤溶酶抑制，不激活纤溶系统；有血栓存在时Sak · plm复合物与血栓中的纤维蛋白结合，α 2_抗纤溶酶对Sak · plm 复合物的抑制速度会下降100倍。临床研究结果表明，它与美国治疗急性心肌梗塞的标准溶栓药物阿特普酶有等同的溶栓疗效，且葡激酶激活纤溶酶原的纤维蛋白特异性更强 (Collen D. et al. Nature Medicine. 4. 279—284(1998))。尽管葡激酶在临床上表现出诸多优点，但是它还存在明显的缺点。葡激酶是异体蛋白，在人体内会产生免疫反应，产生高滴度的中和抗体，甚至会发生超敏反应。因此，降低葡激酶的免疫原性，已经成为将其广泛应用于临床亟待解决的问题。研究表明，Sak存在三个互不重叠的B细胞抗原决定簇，抗原表位1包括K74，E75，R77，抗原表位3包括K35， E38，E80，D82，抗原表位2尚无具体定位，可能包括一些与二聚体形成相关的氨基酸。Petra Α. M.等对^kSTAR的T细胞表位进行了分析，筛选得到了 6个不同的免疫原性区域，其中 Sak的71-87氨基酸序列(C3区)可刺激90%的T淋巴细胞克隆的特异性增殖(Warmerdam P. A. ,et al. J. Immunol.，2002，168 :155-161)。进一步研究发现 C3 区肽段包含 Sl (72-82) 和S2(75-8Q 二个重叠的T细胞表位序列，其中Y73、F76位氨基酸分别为两个表位的关键氨基酸，将它们替换为A，则肽段S1、S2与HLA-DR的结合能力下降。以上研究结果表明，C3 区段是B细胞抗原表位和T细胞抗原表位非常集中的区域。对蛋白质的关键性抗原表位进行聚乙二醇定点修饰，既可以去除B细胞抗原表位，也可以去除T细胞抗原表位，可以显著降低蛋白质的免疫原性，并且可以延长蛋白质药物的体内半衰期。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种聚乙二醇化葡激酶突变体及其制备方法。本专利技术的目的还在于提供一种所述聚乙二醇化葡激酶突变体作为血栓栓塞性疾病溶栓治疗药物的应用。本专利技术的构思是这样的本专利技术选择葡激酶71-87位氨基酸序列之中的任一亲水性氨基酸进行定点突变，将其替换为半胱氨酸(简写为C)，然后使用甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对此半胱氨酸进行定点修饰，希望对该位点进行的聚乙二醇修饰能够综合破坏这个4区段内的T、B细胞表位，所构建的聚乙二醇化葡激酶突变体的免疫原性大大降低，并延长其在体内的血浆半衰期，同时保留其溶解血栓的纤溶活性。所选择的突变氨基酸包括第74 位赖氨酸(简写为K74)、第75位的谷氨酸(简写为E75)、第77位精氨酸(简写为R77)、第 80位的谷氨酸(简写为E80)和第82位天冬氨酸(简写为D82)。具体地，本专利技术设计的聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SPQ是将野生型Sak 的K74替换为半胱氨酸(简写为C)后，再用分子量为5000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇 (简写为即)对葡激酶突变体&ik(K74C)中的半胱氨酸进行定点修饰，经纯化后得到的产物，聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连。本专利技术设计的聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E75C_SPO是将野生型Sak的E75替换为半胱氨酸(简写为C)后，再用分子量为5000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇(简写为 P5)对葡激酶突变体&ik(E75C)中的半胱氨酸进行定点修饰，经纯化后得到的产物，聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连。本专利技术设计的聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(R77C_SPO是将野生型Sak的R77 替换为半胱氨酸后，再用分子量为5000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体 Sak(R77C)中的半胱氨酸进行定点修饰，经纯化后得到的产物，聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连。本专利技术设计的聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E80C-SPO和Mk (E80C-SP10)分别是将野生型Sak的E80替换为半胱氨酸后，再用分子量为5000和10000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体Sak(ESOC)中的半胱氨酸进行定点修饰，经纯化后得到的产物，聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连。本专利技术设计的突变体Sak(D82C-SPO是将野生型Sak的D82替换为半胱氨酸后， 再用分子量为5000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体Sak(D82C)中的半胱氨酸进行定点修饰，经纯化后得到的产物，聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连。本专利技术所述的聚乙二醇化的葡激酶突变体的制备方法包括以下步骤(1)本专利技术选择K74、E75、R77、E80和D82作为突变位点，使用基因工程方法分别将它们突变为半胱氨酸后，经过表达和纯化后得到葡激酶突变体，再用分子量为5000或 10000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、 Sak(ESOC), Sak(D82C)中的半胱氨酸进行定点修饰，经过纯化后得到聚乙二醇化葡激酶突变体，聚乙二醇化葡激酶突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连；与野生型葡激酶相比，所构建聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)、 Sak (E75C-SP5)、Sak (R77C-SP5)、Sak (E80C-SP5)、Sak (E80C-SP10)和 Sak (D82C-SP5)的免疫原性显著降低，纤溶活性基本保留，体内的血浆半衰期明显延长；(2)根据步骤⑴设计Sak突变体的突变引物，并以野生型Mk的表达质粒 PBV-Sak为模板，使用突变引物进行PCR扩增，直接得到表达质粒，并转化感受态大肠杆菌 DH5 α，转化产物涂布在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆；使用质粒提取试剂盒提取阳性克隆的质粒DNA，核苷酸序列分析验证是否发生预计位置的突变；(3) Sak突变体的表达质粒转化宿主细胞得到各个突变体的工程菌，所使用的细胞为大肠杆菌，菌株可以是DH5a、JF1125、JM109或BL21 ；通过升高培养温度(达到42°C)可以诱导 Sak (K74C)、Sak (E75C)、Sak (R77C)、Sak (E80C)、Sak (D82C)基因的表达，表达产物以胞内本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于：是将野生型葡激酶的７１－８７氨基酸序列之中的任一亲水性氨基酸进行定点突变，将其替换为半胱氨酸，通过构建重组表达质粒，得到葡激酶突变体，然后使用甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体中的半胱氨酸进行定点修饰，得到的聚乙二醇化葡激酶突变体。
【技术特征摘要】
1.一种聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于是将野生型葡激酶的71-87氨基酸序列之中的任一亲水性氨基酸进行定点突变，将其替换为半胱氨酸，通过构建重组表达质粒， 得到葡激酶突变体，然后使用甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体中的半胱氨酸进行定点修饰，得到的聚乙二醇化葡激酶突变体。2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SPO是将野生型Sak的K74替换为半胱氨酸，突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连，其中聚乙二醇的平均分子量为 5000。3.根据权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E75C-SPO是将野生型Sak的E75替换为半胱氨酸，突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连，其中聚乙二醇的平均分子量为 5000。4.根据权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于聚乙二醇化葡激酶突变体&ik(R77C-SPO是将野生型Sak的R77替换为半胱氨酸(简写为C)，突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连，其中聚乙二醇的平均分子量为5000。5.根据权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E80C-SPQ和(E80C-SP10)是将野生型Sak的E80替换为半胱氨酸，突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连，其中聚乙二醇的平均分子量分别为5000和10000。6.根据权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(D82C-SPO是将野生型Sak的D82替换为半胱氨酸，突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连，其中聚乙二醇的平均分子量为 5000。7.—种聚乙二醇化葡激酶突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)以野生...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺进田，刘建伟，王改珍，
申请(专利权)人：河北师范大学，
类型：发明
国别省市：13
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