本发明专利技术涉及生物基因工程技术领域，具体的说是一种稳定表达功能基因的亚心型扁藻的应用，即构建稳定表达瑞替普酶(rPA)的亚心型扁藻用于生产溶栓药瑞替普酶。采用本发明专利技术的稳定表达系统，可实现外源基因在亚心型扁藻中的稳定表达，对其藻种的品种改良以及基因工程产品开发都具有重要意义。同时本发明专利技术生产的重组表达瑞替普酶的转基因亚心型扁藻能够作为生物反应器，生产瑞替普酶。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物基因工程
，具体的说是一种稳定表达功能基因的亚心型扁藻的应用。
技术介绍
亚心型扁藻(Platymonas subcordiformis)，又名亚心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)，是一种海洋单细胞绿藻，在分类学上属于绿藻门(Chlorophyta)，青绿藻纲(Prasinophyceae)，扁藻属(Platymonas)。亚心型扁藻具有重要的应用价值，是应用于鱼、对虾、贝类等养殖中的重要饵料微藻，其多糖含量非常高，具有抗肿瘤活性，还可作为油脂代谢调控的贮藏物质来源。另外，亚心型扁藻还可进行光合产氢，在解偶联剂CCCP的诱导下，其产氢效率可达50±3ml/l。在亚心型扁藻中建立遗传转化技术可以为其遗传改造提供有力的工具，工程藻株有望在构建高效微藻反应器(生产高值蛋白、油脂或氢气)、开发口服型渔药等方面发挥独特优势，其核心是建立稳定表达技术，实现外源基因在基因组中的整合与稳定表达。但现有技术仅仅实现了报告基因在亚心型扁藻当代细胞中的瞬间表达，仅能证明基因枪法以及珠磨法可有效将外源基因导入细胞，未广泛验证启动子在扁藻中的通用性，特别是，缺乏对转基因藻株的筛选技术，因此尚无法获得可稳定传代的工程藻株，这距离藻种改造的最终目标有很大距离。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是内科常见急症，死亡率高。近二十年来，溶栓剂的研究经历了三代产品的研发历程。第一代溶栓药物以链激酶和尿激酶为代表，主要特征是无纤维蛋白特异性，副作用大。第二代溶栓药物以t-PA和阿替普酶(alteplase)为代表，特征是有一定程度的纤维蛋白特异性，但半衰期较短，临床应用时需大剂量(50～100mg)连续滴注，价格也比较昂贵。为了克服野生型t-PA的缺点，世界各国的科研人员利用了分子设计、基因工程和蛋白质工程等技术致力于第三代溶栓剂的开发和研究，对人组织型纤溶酶原激活剂进行结构-功能研究，发现了大量的突变体。其中的瑞替普酶以其较长的半衰期(16～20分钟)、能够更快速开通冠状动脉、恢复血液循环的功能，治愈率达到73-83％，成为新一代安全、有效的能够替代链激酶，t-PA的溶解血栓药物。瑞替普酶分子结构中含有9对二硫键。含有二硫键的真核生物蛋白，通常在真核生物体系中表现出天然活性的结构，而在原核生物体系中表达，常常因组蛋白分子内及分子间的二硫键结构错配，产生无活性的蛋白质。目前瑞替普酶主要由大肠杆菌工程菌株非融合表达发酵生产，表达以包涵体的形式存在，然后要经过复杂的复性，分离纯化流程。而这样生产的瑞替普酶复性率低，下游工艺成本非常昂贵。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种稳定表达功能基因的亚心型扁藻的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：将功能性外源基因—瑞替普酶-->(rPA)重组于通用型启动子下游，然后插入含有选择标记基因的质粒中，构建成转化用的载体，通过基因枪法或玻璃珠研磨法，将质粒转到亚心型扁藻细胞中，经除草剂筛选，获得转基因亚心型扁藻。此转基因亚心型扁藻能够作为生物反应器，生产瑞替普酶。其中：所述通用型启动子是SV40启动子或CaMV35S启动子；所述除草剂为草丁膦；所述选择标记基因为bar基因；所述的瑞替普酶基因为rPA基因。本专利技术方法成功构建了亚心型扁藻的稳定表达系统。通过本专利技术能够有效的将瑞替普酶重组到亚心型扁藻的基因组中，并通过筛选获得转基因突变藻株。与现有技术相比，本专利技术实现了亚心型扁藻基因工程技术的重点突破，具有如下有益效果：1、本专利技术在载体元件上，试验了动物病毒来源的启动子SV40启动子和植物病毒来源的启动子CaMV35S启动子在亚心型扁藻中的有效性，拓展了亚心型扁藻中可应用启动子的范围。2、在筛选标记方面，本专利技术的实验证明：亚心型扁藻对除草剂草丁膦非常敏感，采用一种可行的选择标记基因-选择压力组合(bar基因-草丁膦)是本专利技术的又一技术特点。3、本专利技术能将外源基因整合到亚心型扁藻基因组上，并能实现外源基因的稳定表达。4、本专利技术获得的转基因亚心型扁藻，可以用做生物反应器，生产无需通过变性、复性等处理就具有生物活性的瑞替普酶。附图说明图1为本专利技术实施例提供的质粒pSVbar物理图谱。图2为本专利技术实施例提供的转基因亚心型扁藻(转bar基因)基因组PCR产物电泳图。图3为本专利技术实施例提供的转基因亚心型扁藻Southern杂交图。图4为本专利技术实施例提供的质粒CaMV35S-bar-nos/SV40-rPA物理图谱。图5为本专利技术实施例提供的转基因亚心型扁藻(转bar和rPA基因)基因组PCR产物电泳图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的方法及该方法所达到的效果作进一步详细说明。实施例1：通过导入选择标记基因实现对转基因藻株的筛选采用含有草丁膦抗性基因(bar)的质粒pSVbar(SV40启动子-bar-SV40终止子)(参见图1)。用基因枪法和珠磨法分别导入亚心型扁藻细胞中，经草丁膦筛选，获得抗性藻落；在抗性单藻落中，检测到bar基因已经整合到基因组中。一、通过敏感性实验，确定选择标记基因和转化载体首先，将亚心型扁藻培养至对数生长期，藻细胞浓度约为5.0×105细胞每毫升。浓度测定方法是先将1％碘液加入亚心型扁藻培养液中固定藻细胞并染色，然后用血细胞计数板计数。计数三次取其平均值，作为结果，用于计算藻液浓度。藻液浓度＝计数结果/观察的中格数×25(或16)×104。-->然后将四种抗生素卡那霉素、链霉素、壮观霉素、氯霉素和除草剂草丁膦分别配成一定浓度的母液。在液体培养条件下，将藻液分装到试管中(试管经高压灭菌处理)，每支试管5ml藻液。最后将四种抗生素和除草剂分别加到藻液中。四种抗生素浓度梯度是200，400，800，和1600μg ml-1；除草剂的浓度梯度是5，10，15，20，25，30μg ml-1。每种处理重复三次，并同时都设置对照组(对照组即为不添加抗生素或草丁膦且起始藻液浓度与处理组相同的藻液)。培养条件如下：温度23℃，光照强度4000勒克斯，每天光照时间12h，黑暗时间12h。每24小时计数一次，共计数7次(即共培养7天)。四种抗生素即使在最高浓度1600μg ml-1也不能抑制亚心型扁藻的生长；草丁膦在25、30μg ml-1浓度时可在7天内完全杀死细胞。在固体培养条件下，每个处理组的固体培养基中抗生素或草丁膦的浓度梯度与液体培养条件下相同。每个固体培养板上涂布6.0×105藻细胞。每种处理重复三次，并同时都设置对照组(对照组即为不添加抗生素或草丁膦且起始藻量与处理组相同的固体平板)。培养条件如下：温度23℃，光照强度4000勒克斯，每天光照时间12h，黑暗时间12h。共培养15天，观察藻落的生长情况。添加抗生素的固体平板上，藻落生长情况(藻落的数量和大小)与对照组相似；添加草丁膦的固体平板上，藻落数量比对照组要少，草丁膦浓度20、25、30μg ml-1的固体平板上，没有藻落长出。根据亚心型扁藻对四种抗生素和除草剂草定膦的敏感性实验结果，确定草丁膦作为亚心型扁藻遗传转化的筛选压力。同时，选定草丁膦抗性基因bar基因作为亚心型扁藻遗传转化的选择标记基因。因此，含有bar基因的质粒pSVb本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种稳定表达功能基因的亚心型扁藻的应用，其特征在于：构建稳定表达瑞替普酶（ｒＰＡ）的亚心型扁藻用于生产溶栓药瑞替普酶。
【技术特征摘要】
1.一种稳定表达功能基因的亚心型扁藻的应用，其特征在于：构建稳定表达瑞替普酶(rPA)的亚心型扁藻用于生产溶栓药瑞替普酶。2.按权利要求1所述的稳定表达功能基因的亚心型扁藻的应用，其特征在于：所述构建稳定表达瑞替普酶(rPA)的亚心型扁藻为将功能性外源基因—瑞替普酶(rPA)基因重组于通用型启动子下游，然后插入含有选择标记基因的质粒中，构建成转化用的载体，通过基因枪法或玻璃珠研磨法，将质粒转到亚...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔玉琳，姜鹏，陈华新，李富超，陈英杰，秦松，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95
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