根癌农杆菌介导的花生高效转基因方法技术

本发明专利技术涉及植物转基因技术，尤其涉及一种基于根癌农杆菌介导的花生转基因方法。本发明专利技术的根癌农杆菌介导的花生高效转基因方法，包括如下步骤：(1)使用常规方法将已构建好的携带目的基因的Ti质粒载体转入根癌农杆菌；(2)转化菌体在YEP培养基中振荡培养；(3)取取2-6μl重悬的菌液，在花生生长的适宜期注入花生植株，使农杆菌在花生植株内侵染、转化；(4)收获种子后，取花生子叶组织薄片，快速提取待测样品DNA作为PCR模板；(5)使用依据目的基因序列设计的特异性引物进行PCR鉴定，电泳检测结果。本发明专利技术通过根癌农杆菌介导的转基因技术，可方便快速获得可育后代，无需单独的组培再生阶段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物转基因技术，尤其涉及一种基于根癌农杆菌介导的花生转基因方法。
技术介绍
花生是世界上最重要的油料作物之一。迄今所建立的花生转基因技术大多需要植株组培再生的程序，因而表现出较强的基因型依赖性且转化率较低。有重要经济价值的亲本材料未必容易转化。缺少一套通用性强的转基因技术，已经成为制约花生分子生物学基础研究和育种应用研究的瓶颈。国际半干旱热带作物研究所(ICRISAT)通过PCR直接筛选，获得了无选择标记的转基因花生，西班牙型品种几对转化率在75%以上，但仍需要组织培养的步骤。广东省农科院作物所梁炫强团队，报道了以珍珠豆型品种粤油7号带子叶的胚轴为外植体、由根癌农杆菌介导的花生高效转化体系，采用该体系可显著提高遗传转化率，gus基因阳性表达率高达73. 3%，但该技术仍需要组培步骤，外源基因整合与转录的分子验证工作未见报道。我们申报了花器注射获得转基因花生的专利技术专利(专利申请号201010182M3. 1)，该方法转化率高，且无需组培再生步骤，但容易获得外源基因多拷贝整合的花生转化体，不适用于农杆菌介导的遗传转化。无论从花生遗传改良的角度，从花生作为植物生物反应器生产有用产品或作为基因功能分析工具的角度，还是从通过插入突变分离重要功能基因的角度考虑，都有必要建立一套农杆菌介导的、高转化率、基因型依赖性小或无基因型依赖性、简便易行的花生转基因技术。
技术实现思路
本专利技术的技术效果能够克服上述缺陷，提供一种，其弥补现行花生转基因技术转化率普遍偏低、基因型依赖性强、操作繁琐的不足。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案其包括如下步骤(1)使用常规方法将已构建好的携带目的基因的Ti质粒载体转入根癌农杆菌；(2)转化菌体在YEP培养基中振荡培养；(3)取2-6 μ 1重悬的菌液，在花生生长的适宜期注入花生植株，使农杆菌在花生植株内侵染、转化；(4)收获种子后，取花生子叶组织薄片，快速提取待测样品DNA作为PCR模板；(5)使用依据目的基因序列设计的特异性引物进行PCR鉴定，电泳检测结果。本专利技术的技术是在花生植株生长的适宜时期，利用器械造成损伤，使农杆菌得以进入，侵染、转化，无需经过组培再生阶段，获得转基因后代。转化菌体在YEP培养基中的培养温度为25 V -30°C。振荡培养至0D_值在 0.1-0. 6为止。花生生长的适宜期为花生播种后30-60天。菌液注入花生植株的位置为花3生植株的地上部分。如转移NPT II基因，其特异性引物可采用WNPT-2F和WNPT-2R，其中引物 WNPT-2F 的序列(5，一 3，，下同)为 ATGACTGGGCACAACAGACAA，引物 WNPT-2R 的序列为 GCAAGGTGAGATGACAGGAGA。本专利技术通过根癌农杆菌介导的转基因技术，可方便快速获得可育后代，无需单独的组培再生阶段。附图说明图1为PCR检测转基因材料，采用NPT II基因特异性引物WNPT-2F和WNPT_2R(M DL2000 ；P 阳性对照；N 阴性对照)；图2为RT-PCR检测鉴定PCR阳性转基因材料(M :DL2000 ；P 阳性对照；N 阴性对照)。具体实施例方式本专利技术的具体应用方法其包括如下步骤(1)使用常规方法将已构建好的携带目的基因的Ti质粒载体转入根癌农杆菌；(2)转化菌体在YEP培养基中25°C _30°C振荡培养至OD6tltl值在0. 1-0. 6为止；C3)取2-6 μ 1重悬的菌液，在花生播种后30-60天注入花生植株的地上部分，使农杆菌在花生植株内侵染、转化；(4)收获种子后，取花生子叶组织薄片，快速提取待测样品DNA作为PCR模板；(参见“花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法”，专利申请号200910255786. 0)(5)使用依据目的基因序列设计的特异性引物进行PCR鉴定，电泳检测结果。用本专利技术的方法对四个花生品种(如下表1所述)进行转基因操作，转移的目的片段中含有NPT II基因。收获后，以NPT II特异性引物采用直接PCR法鉴定转基因材料 (如图1所示)，PCR产物测序结果表明，与NPT II基因序列并无不同。在四个花生品种中， 除多粒型品种法库四粒红转化率在2. 08%外，其余3个品种均在40%以上，花育20号甚至高达86.51% (如表1)。大粒型品种和珍珠豆型品种是国内花生生产的主要品种类型，多粒型品种种植范围较小。对PCR检测为阳性的种子进一步做RT-PCR鉴定，结果证明NPT II 能够正常转录(如图2所示)，ELI SA检测证实可获得预期蛋白产物。表1四个花生品种使用该法转基因效果权利要求1.一种，其特征在于，包括如下步骤(1)使用常规方法将已构建好的携带目的基因的Ti质粒载体转入根癌农杆菌；(2)转化菌体在YEP培养基中振荡培养；(3)取取2-6μ 1重悬的菌液，在花生生长的适宜期注入花生植株，使农杆菌在花生植株内侵染、转化；(4)收获种子后，取花生子叶组织薄片，快速提取待测样品DNA作为PCR模板；(5)使用依据目的基因序列设计的特异性引物进行PCR鉴定，电泳检测结果。2.根据权利要求1所述的，其特征在于，转化菌体在YEP培养基中的培养温度为25°C -30°C。3.根据权利要求2所述的，其特征在于，振荡培养至OD6tltl值在0. 1-0. 6为止。4.根据权利要求1所述的，其特征在于，花生生长的适宜期为花生播种后30-60天。5.根据权利要求1或3所述的，其特征在于，菌液注入花生植株的位置为花生植株的地上部分。全文摘要本专利技术涉及植物转基因技术，尤其涉及一种基于根癌农杆菌介导的花生转基因方法。本专利技术的，包括如下步骤(1)使用常规方法将已构建好的携带目的基因的Ti质粒载体转入根癌农杆菌；(2)转化菌体在YEP培养基中振荡培养；(3)取取2-6μl重悬的菌液，在花生生长的适宜期注入花生植株，使农杆菌在花生植株内侵染、转化；(4)收获种子后，取花生子叶组织薄片，快速提取待测样品DNA作为PCR模板；(5)使用依据目的基因序列设计的特异性引物进行PCR鉴定，电泳检测结果。本专利技术通过根癌农杆菌介导的转基因技术，可方便快速获得可育后代，无需单独的组培再生阶段。文档编号C12N15/84GK102199621SQ20111005853公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月11日 优先权日2011年3月11日专利技术者于洪涛, 唐月异, 崔凤高, 张建成, 李贵杰, 杨伟强, 王传堂, 王秀贞, 禹山林 申请人:山东省花生研究所本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种根癌农杆菌介导的花生高效转基因方法，其特征在于，包括如下步骤：（１）使用常规方法将已构建好的携带目的基因的Ｔｉ质粒载体转入根癌农杆菌；（２）转化菌体在ＹＥＰ培养基中振荡培养；（３）取取２－６μｌ重悬的菌液，在花生生长的适宜期注入花生植株，使农杆菌在花生植株内侵染、转化；（４）收获种子后，取花生子叶组织薄片，快速提取待测样品ＤＮＡ作为ＰＣＲ模板；（５）使用依据目的基因序列设计的特异性引物进行ＰＣＲ鉴定，电泳检测结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王传堂，王秀贞，李贵杰，于洪涛，唐月异，杨伟强，张建成，崔凤高，禹山林，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：95