时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条及其制备方法和应用。该试纸条由Fusion5膜、硝酸纤维素膜和吸水纸三部分组成，通过双抗体夹心法或竞争法原理，利用时间分辨荧光微球作为免疫标记物，对待测抗原或抗体进行准确快速的定量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于定量检测的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
技术介绍
目前的免疫层析(lateral flow immunoassay，LFIA)快速检测试纸条多以胶体金、彩色乳胶微球或者荧光素作为标记物。基于胶体金标记技术开发的快速检测产品，存在灵敏度低，只能定性或者半定量，批间差异较大等问题；彩色乳胶微球虽然批间差有所改进，但灵敏度依然较低，也只能定性或半定量；基于荧光素标记技术的免疫层析灵敏度有了较大提高，也能进行定量检测，但是由于样本中含有较高的荧光本底信号，且Stock位移较小，会对检测产生较大的影响。时间分辨荧光(Time-resolved Fluorescence,TRF)是一种非同位素荧光标记物， 与普通荧光相比，具有Stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。本专利技术将时间分辨荧光乳胶微球标记和免疫层析两大技术结合，得到时间分辨荧光免疫层析法(Time-resolved Fluorescence lateral flow immunoassay，TRF-LFIA)，幵发出能够精确定量的快速免疫层析检测试纸条。同时，本专利技术对于传统的免疫层析膜组合方式进行了改进，将原有的四层甚至五层膜系统改变成三层膜系统。传统的免疫层析膜组合方式包括样品垫、滤血膜、结合垫、分离膜(硝酸纤维素膜)、吸水垫等四到五层(四层则没有滤血功能或者将滤血功能与样品垫功能组合)。GE 公司旗下Whatman开发了具有五合一功能的膜Fusi0n5，集合了上述五种膜的功能，但 Fusion5由于孔径较大，抗体难以固定，需要制备特殊的Stone用于固定抗体，生产工艺较为复杂，仪器设备要求较高，开发的免疫层析试剂只能用于定性检测。本专利技术利用FUsi0n5替代传统的样品垫、滤血膜、结合垫，将原有的四层甚至五层膜系统简化，开发出只需要三层膜结构的快速定量免疫层析检测试纸，不仅使生产工艺得到了简化，而且有效的降低了产品的批内差和批间差，提高了检测灵敏度，极具实用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种新型的、能快速定量检测的时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用。本专利技术一方面公开了一种时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，该试纸条包括 Fusi0n5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分。硝酸纤维素膜位于中间，Fusi0n5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端。其中，Fusi0n5膜上设有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，T线接上包被抗体或抗原，C线包被亲和素或链霉亲和素。所述时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有针对待测抗原的单抗或者多抗的荧光微球，或者检测微球为表面包被有针对待测抗体的抗原的荧光微球；质控微球为表面包被有生物素标记蛋白的荧光微球。所述荧光微球中填充了镧系元素化合物；较优的，该镧系元素螯合物为铕螯合物； 最优的，该铕螯合物可为Eu (TTA) 3/Τ0Ρ0或Eu (TTA) 3/Wien。所述生物素标记蛋白可以是任何一种不影响生物素/链霉生物素与亲和素的结合，并可被生物素标记的蛋白。较优的，所述蛋白可以是牛血清Y-球蛋白(BGG)或小牛血清白蛋白(BSA)。优选的，所述时间分辨荧光微球粒径范围为100 lOOOnm。硝酸纤维素膜上，T线上包被的抗体为针对待测抗原的单抗或多抗，或者为针对待测抗体的抗原的单抗或多抗；T线上包被的抗原为待测抗原的竞争性抗原。优选的，所述时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。本专利技术第二方面公开了一种时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条的制备方法， 包括以下步骤(1)质控微球制备1)用生物素标记蛋白；幻采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球。(2)检测微球制备采用针对待测抗原的单抗或多抗、或者采用针对待测抗体的抗原，包被醛基修饰的荧光微球。(3)空白大卡粘贴在带有背胶的塑料底板上采用搭接的方式，首先粘贴硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素膜左右两端分别粘贴吸水纸和Fusi0n5膜。(4)喷膜将质控微球和检测微球采用释放缓冲液混合稀释到一定浓度，喷到Fusion膜的微球区；T线溶液和C线溶液稀释，分别喷到硝酸纤维素膜的T线和C线。(5)干燥及切条将上述喷好试剂的大卡烘干、切条。较优的，步骤中用到的释放缓冲液含有10 40%蔗糖、3 10%海藻糖、 0. 5 N，O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)、0. 2 0. 5%庆大霉素。较优的，步骤中检测微球终浓度0. 5 2mg/ml，质控微球终浓度0. 05 0. 2mg/ml ；T线抗原或则抗体终浓度0. 5 2mg/ml，亲和素或链霉亲和终浓度0. 5 ^iig/ ml ；C、T线喷膜液量为0. 5 2 μ 1/cm,微球喷膜量为2 8 μ 1/cm。较优的，步骤(5)中所述的烘干可在恒温烘箱或者烘房中，37°C烘干6 M小时。本专利技术第三方面公开了一种时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条的应用。本专利技术的试纸条可通过双抗体夹心法或竞争法原理测定生物分子，适用于所有的采用双抗体夹心法模式或竞争法模式的免疫层析检测。双抗体夹心法待测样品通过层析作用与包被有抗体的时间分辨荧光纳米微球(检测微球)结合，在毛细作用下，依次通过Fusion、硝酸纤维素膜，并与硝酸纤维素膜T 线上固定的另一抗体结合，形成双抗体免疫夹心复合物。在层析过程中，质控微球(表面包被有生物素，混合在检测微球中)也随着样品的移动而前进，并在硝酸纤维素膜C线位置被固定的亲和素捕获，在缓冲液冲洗下，未反应的微球继续移动到吸水垫位置。T线位置捕获的微球量与待测样品中的抗原浓度成正相关，而C线位置捕获的质控微球通常是固定的。 通过时间分辨荧光读条仪对T、C线信号进行扫描，根据T线信号与待测抗原浓度成正相关， 获得待测样品中待测抗原浓度。竞争法待测样品中的抗原分子通过层析作用与过量的标记有抗体的时间分辨荧光纳米微球(检测微球)结合，在毛细作用下，依次通过Fusion、硝酸纤维素膜，未结合抗原的检测微球与硝酸纤维素膜T线上固定的竞争抗原结合，形成抗原抗体复合物。在层析过程中，质控微球(表面包被有生物素，混合在检测微球中)也随着样品的移动而前进，并在硝酸纤维素膜C线位置被固定的亲和素捕获，在缓冲液冲洗下，未反应的微球继续移动到吸水垫位置。T线位置捕获的微球量与待测样品中的抗原浓度成负相关，而C线位置捕获的质控微球通常是固定的。通过时间分辨荧光读条仪对T、C线信号进行扫描，根据T线信号与待测抗原浓度成负相关，获得待测样品中待测抗原浓度。本专利技术的时间分辨荧光免疫层析试纸条灵敏度高，批内精密度可达10%左右，批间精密度可达15 %，可同时检测全血、血清、血浆、尿液样本，250mg/dL血红蛋白、500mg/dL 甘油三酯、10mg/dL胆红素对本试纸条的检测无影响，远超过市场上大多数免疫层析快速诊断产品。附图说明图1 本专利技术试纸条结构示意图(1.塑料底板2.Fusi0n5膜3.硝酸纤维素膜 4.吸水纸5.加样区6.微球区7. T线区8. C线区)图2 :CRP试纸条检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种时间分辨荧光免疫定量检测试纸条，其特征在于，包括Ｆｕｓｉｏｎ５膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Ｆｕｓｉｏｎ５膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Ｆｕｓｉｏｎ５膜上有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，检测线上包被抗体或抗原，质控线上包被亲和素或链霉亲和素。

【技术特征摘要】
1.一种时间分辨荧光免疫定量检测试纸条，其特征在于，包括Fusi0n5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusi0n5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，检测线上包被抗体或抗原，质控线上包被亲和素或链霉亲和素。2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有针对待测抗原的单抗或多抗的荧光微球，或者检测微球为表面包被有针对待测抗体的抗原的荧光微球；质控微球为表面包被有生物素标记蛋白的荧光微球。3.如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为 100 lOOOnm。4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述检测线上包被抗体为针对待测抗原的单抗或多抗，或者为针对待测抗体的抗原的单抗或多抗；检测线上包被抗原为待测抗原的竞争性抗原。5.一种如权利要求1所述的试纸条的制备方法，其制备步骤如下(1)质控微球制备a)用生物素标记蛋白；b)采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球；(2)检测微球制备采用针对待测抗原的单抗或多抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：石晓强，马顺华，吴茜，王海蛟，赵卫国，
申请(专利权)人：博阳生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31