本发明专利技术公开了一种能同时检测水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重PCR试剂盒，其组成包括：DNA聚合酶，dNTPs，引物，PCR缓冲液，双蒸水；其特征在于：所述的引物由3对引物组成，其中，第1对引物的序列为5′-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3′和5′-CTTGAGCTTTCGACCTTC-3′，第2对引物的序列为5′-AACTGGGCGGAGCCTAAA-3′和5′-CAGAGCGAAGATAAGCAG-3′，第3对引物的序列为?5′-GAAACCACGGTGGAGACA-3′和5′-AAGAGTTGACCTGGAGGG-3′。采用本发明专利技术多重PCR试剂盒可在同一反应体系中同时检测出是否有水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的感染或多重感染，具有较高的特异性和敏感性，从而节省时间和试剂，可以为貂群的快速和早期诊断提供有效的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开了一种能同时检测水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重PCR试剂盒，属于水貂烈性病毒的检测领域。
技术介绍
犬瘟热病(Canine distemper,⑶)是由副粘病毒科麻疹病毒属禽犬瘟热病毒 (CDV)引起的犬科、鼬科及部分浣熊科动物的一种高度接触性、致死性传染病(文献1)。特征表现为病毒粒子有囊膜，直径大小约为150 nm，包括一个线性、负义单链RNA基因组，大小约为15.0 kb，病毒只有一个血清型。该病的传染性极强，死亡率可高达80%以上，病程早期双相体温热型，眼、鼻、消化道等粘膜炎症，随后以支气管炎、卡他性肺炎、胃肠炎为特征。 病后期可见有神经症状出现如痉挛、抽搐，部分病例可出现鼻部和角垫高度角化，并可继发肺炎、肠炎等症状(文献2)。传染源主要是病犬、病兽和带毒动物，其中患犬瘟热的病犬是最危险的传染源。主要是通过患病动物的眼、鼻分泌物、唾液、尿和粪便排出病毒(文献3)。 快速诊断该病对控制犬瘟热病的大规模流行有着积极的意义。水貂肠炎细小病毒病(Mink enteritis)是由细小病毒科细小病毒属水貂肠炎细小病毒(MEV)引起的以剧烈腹泻为主要临床特症的急性、烈性和高度接触性传染病(文献 4)。病毒颗粒无囊膜，直径约25 nm，整个病毒粒子呈20面体对称，基因组为单分子线状 DNA,大小约为5. 0 kb (文献5)，病毒只有一个血清型。病毒大量的存在于病貂的肝脏、脾脏及肠道，并从粪便大量排出。病貂、带毒貂是主要传染源，病毒主要通过病貂的粪便、尿液和各种分泌物散播。本病主要发生在夏季，近年来有推延到秋季的趋势。貂群一旦感染，如不采取措施，会引起地方性、周期性流行，通常会在翌年分窝前后的幼貂群中再次发生。快速诊断该病可有效地控制水貂细小病毒性肠炎的流行。水貂阿留申病(Mink aleutian disease)是由水貂阿留申病毒(MADV)引起的水貂接触性、慢性、进行性传染病。主要侵害网状内皮细胞系统。以浆细胞增多，血丙种球蛋白增高，持续性病毒血症，免疫复合物造成的肾小球肾炎和肝炎，贫血及进行性衰竭为特征 (文献6)。水貂的遗传类型与本病的易感性有密切关系，蓝宝石彩貂发病率较高。本病传入貂群，开始多呈隐形流行，随着时间的延长和病貂的积累，表现出地方性流行，造成严重损失(文献7)。建立定期检疫制度是净化貂群、消灭阿留申病的最好途径，阳性(感染)貂严格淘汰，如此检测数年，可达到基本净化的目的。近年来随着毛皮动物(水貂等)养殖业的不断发展，以具备相当数量的产业化规模。同时作为水貂养殖业的3大疫病犬瘟热病、肠炎细小病毒病、阿留申病已在主要养殖区域大规模流行与传播，严重影响毛皮动物养殖业发展，对农业经济发展、社会稳定和人类健康也带来不良影响。这3种疫病的常规诊断方法是病毒分离鉴定、血凝实验、琼脂扩散试验、对流免疫电泳和动物感染实验等(文献8-10)，这些方法都存在敏感性低，特异性不足， 操作费时费力等局限性。因此，建立一种快速、敏感、特异、简便的同时检测这3种病毒的分子生物学方法有着重要的意义，并对病毒的复合感染诊断有着积极的帮助。参考文献1杨应丽.犬瘟热病毒研究进展.河北农业科学.2006. (4) :99-102. 2高大潮.犬瘟热病的诊治.现代农业科技.2009 (9) 255. 3赵新龙.犬瘟热病流行特点和诊治.中国畜禽种业.2009 (12)92 4闫喜军，柴秀丽，吴威，等.水貂肠炎细小病毒分离鉴定.畜牧与兽医·2007(3):52-525张海玲，闫喜军，柴秀丽，等.水貂肠炎细小病毒PCR检测方法的建立和应用.特产研究.2007( :1-36马建，华育平.水貂阿留申病发病机理的研究进展.动物医学进展.2005 (1):39-42 7王克祥，刘永逵，孙宏磊.水貂阿留申病的研究进展.中国畜牧兽医·2010(12):223-2258肖家美，程世鹏，赵艳.水貂阿留申病诊断方法的研究进展。特产研究·2007(2):70-729王好，张宇，钱爱东.犬瘟热诊断方法的研究进展.畜牧与饲料科学.2009(10):67-69 10刘剑郁.犬细小病毒诊断研究进展.养犬.2007 (2) 8-10
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种能同时检测包括水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重PCR试剂盒；本专利技术的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。本专利技术的技术方案是这样实现的检测犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒的三重PCR试剂盒包括3对特异性引物，⑶V，MEV, ADV各自的扩增目标长度为33^p、 553bp和45 Ibp，引物序列为CDV引物CDV-Pl 5' -GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3‘ CDV-P2 5， -CTTGAGCTTTCGACCTTC-3， MEV引物MEV-Pl 5’ -AACTGGGCGGAGCCTAAA-3’ MEV-P2 5’ -CAGAGCGAAGATAAGCAG-3’ ADV 引物ADV-Pl 5’ -GAAACCACGGTGGAGACA-3’ ADV-P2 5’ -AAGAGTTGACCTGGAGGG-3‘为了达到更好的检测效果，本专利技术试剂盒还带有3个阳性对照质粒，包括CDV阳性对照质粒；MEV阳性对照质粒和ADV阳性对照质粒。并另外包含1个阴性对照。其中，所述的3个阳性对照质粒的制作方法为(1)以犬瘟热⑶V3株的cDNA为模板，以⑶V-Pl和⑶V-P2为引物进行PCR扩增，得到33^p的扩增产物，回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到⑶V阳性对照质粒；(2)以水貂肠炎细小病毒MEVB株的DNA为模板，以MEV-Pl和MEV-P2为引物进行PCR扩增，得到55;3bp的扩增产物，回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到MEV阳性对照质粒；(3)以水貂阿留申病毒ADV-G株的DNA为模板， 以ADV-Pl和ADV-P2为引物进行PCR扩增，得到451bp的扩增产物，回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到ADV阳性对照质粒。所述的阴性对照是蒸馏水。所述的DNA聚合酶为rTaq DNA聚合酶。本专利技术试剂盒在检测犬瘟热病毒、肠炎细小病毒、水貂阿留申病毒中的应用 25μ 反应体系rTaq DNA 聚合酶 2. OU ；dNTPs (2. 5mmol/) 2. Ομ ；引物 CDV-Pl 以及CDV-P2,MEV-Pl 以及 MEV-P2，ADV-P1 以及 ADV-P2 各 IOpmol ；10 倍 PCR Buffer2. 5μ ；待测模板2. Ομ ，其余的由蒸馏水补充至25PL。PCR 反应程序为95°C 5min ；94°C 45s，55°C 30s, 72°C 30s，30 个循环；72°C IOmin0判定结果如果从待检测的样品中扩增到了 335bp片段，则该检测样品含有犬瘟热病毒；如果从待检测的样品中扩增到了 553bp片段，则该检测样品含有肠炎细小病毒；从待检测的样品中扩增到了 451bp片段，则该检测样品含有水貂阿留申病毒。如果同时检测到2个或者3个目标大小条带，则该检测样品同时含有该目标代表的病毒。本专利技术的积极效果是1根据病毒基因组的保守基因序列设计引物，得到了检测包括犬瘟热病毒、本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．检测水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重ＰＣＲ试剂盒，由ＤＮＡ聚合酶，ｄＮＴＰｓ，引物，ＰＣＲ缓冲液，双蒸水组成；其特征在于：由ＣＤＶ，ＭＥＶ，ＡＤＶ３对引物组成，引物序列为：ＣＤＶ 引物：ＣＤＶ－Ｐ１ ５’－ＧＡＴＡＡＡＧＣＡＴＧＴＣＡＴＴＡＴＡＧＴＣＣＴＡＡ－３’ＣＤＶ－Ｐ２ ５’－ＣＴＴＧＡＧＣＴＴＴＣＧＡＣＣＴＴＣ－３’ＭＥＶ 引物：ＭＥＶ－Ｐ１ ５’－ＡＡＣＴＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣＴＡＡＡ－３’ＭＥＶ－Ｐ２ ５’－ＣＡＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＡＧＣＡＧ－３’ＡＤＶ 引物：ＡＤＶ－Ｐ１ ５’－ＧＡＡＡＣＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡ－３’ＡＤＶ－Ｐ２ ５’－ＡＡＧＡＧＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧ－３’，ＣＤＶ，ＭＥＶ，ＡＤＶ各自的扩增目标长度为３３５ｂｐ、５５３ｂｐ和４５１ｂｐ。
【技术特征摘要】
1.检测水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重PCR试剂盒，由DNA聚合酶，dNTPs，引物，PCR缓冲液，双蒸水组成；其特征在于由⑶V，MEV，ADV3对引物组成，引物序列为CDV引物CDV-Pl 5' -GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3‘CDV-P2 5， -CTTGAGCTTTCGACCTTC-3，MEV引物MEV-Pl 5’ -AACTGGGCGGAGCCTAAA-3’MEV-P2 5’ -CAGAGCGAAGATAAGCAG-3’ADV 引物ADV-Pl 5’ -GAAACCACGGTGGAGACA-3’ADV-P2 5’ -AAGAGTTGACCTGGAGGG-3’，CDV，MEV, ADV各自的扩增目标长度为335bp、553bp和45Ibp。2.根据权利要求1所述检测水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重PCR 试剂盒，所述的引物CDV阳性对照质粒、MEV阳性对照质粒和ADV阳性对照质粒，其特征在于还包括1个阴性对照。3.根据权利要求1、2所述检测水貂犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重 PCR试剂盒，其特征在于所述的CDV阳性对照质粒的制备方法为(1) 以水貂犬瘟热病毒的cDNA为模板，以5 ’ -GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3，和 5’ -CTTGAGCTTTCGACCTTC-...
【专利技术属性】
技术研发人员：易立，程世鹏，王建科，杨莘，许红丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，吉林特研生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：22
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