一种大量个体化天然干扰素诱导方法技术

本发明专利技术属医学生物技术领域。本发明专利技术公开了一种个体化天然干扰素的生成方法。本发明专利技术将编码EB病毒膜蛋白LMP1的C末端的2个NcoI位点间的495bp长度的LMP1致癌性片段缺失突变，但保持其转化B淋巴细胞为淋巴母细胞的能力。将LMP1缺失突变体插入腺病毒载体，感染人外周血B淋巴细胞，经仙台病毒诱导后，B淋巴细胞能表达大量个体化的天然干扰素。该天然干扰素具有激发个体免疫反应，抑制肿瘤、肝炎的作用。有益效果是：能高效发挥其抗肿瘤、抗病毒作用，同时避免了基因工程干扰素产生的副作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程和医学生物
具体是一种大量个体化天然干扰素诱导方法。涉及利用PCR技术获得EB病毒的LMP1核苷酸序列，然后利用重叠PCR技术将LMP1的C末端的2个Nco I位点间的495bp的致癌性片段缺失突变，但保持其转化B淋巴细胞为淋巴母细胞的能力。将获得的LMP1缺失突变体克隆入腺病毒载体，感染患者外周血淋巴细胞，再利用仙台病毒诱导，产生大量个体化的天然干扰素，应用于患者，能高效发挥其抗肿瘤、抗病毒作用，同时避免了基因工程干扰素产生的副作用。专利技术背景干扰素（Interferon，IFN） 是1957 年Issac 和Linderman在研究病毒间干扰现象时发现的，是一种由病毒感染诱导产生的，具有抗病毒作用的细胞因子[1]。它可以与细胞膜上的特异性受体结合，诱导产生特异性蛋白质和酶，从而抑制病毒增殖；它可使肿瘤细胞溶解并改变肿瘤细胞表面的标志，使之容易被免疫细胞识认并消灭[2]；也能增强B细胞、T细胞活性，促进吞噬细胞的吞噬作用，增强机体免疫应答能力[3]。干扰素的受体分布广泛，几乎所有的有核细胞表面都存在，因此干扰素的作用范围非常广泛[4]。根据产生细胞、受体和活性等将干扰素分为I型、Ⅱ型两种类型。Ⅰ型IFN家族主要包括IFN-α、IFN-β，同时包括亚家族成员IFN-κ、IFN-ε、IFN-ω等。Ⅱ型IFN家族只有IFN-γ[5]。Ⅰ型IFN家族位于人染色体9号短臂，一些刺激因素如病毒、细菌和某些化学合成物质等能够刺激淋巴细胞以及体细胞产生Ⅰ型IFN，发挥其抑制病毒复制、抑制肿瘤细胞增殖、抗原修饰及免疫修饰等生物学作用[6,7]。Ⅱ型IFN位于人12号染色体，除了在免疫缺陷型疾病中发挥作用，也和慢性炎症和自体免疫性疾病有密切联系[8]。按生产途径，将用人血淋巴细胞生产的干扰素称为天然干扰素，用基因重组技术生产的称为重组干扰素。天然干扰素需要培养人外周血淋巴细胞，用病毒诱导干扰索分泌，然后离心、分离获得上清液，再经过纯化制得。这种方法得到的干扰素具有天然的分子结构和生物活性，但是生成效率较低且成本太高，难以大规模生产[9]。由于天然干扰素在应用中的限制，20世纪70年代起科学家开始探索的基因工程干扰素生产技术，成为目前产业化大规模生产干扰素的方法，并广泛应用于临床[10]。与天然干扰素相比，重组干扰素尽管具有纯度高、生成效率高、成本低等优点，但是仍然存在问题。首先，重组干扰素的疗效较差，例如仅有50%的丙肝患者和10%的黑素瘤患者对其敏感[11]。这是由于干扰素有较严格的种属特异性，外源性的干扰素可刺激机体产生抗体，导致其疗效降低。其次是副作用的产生，最常见的是发热及流感样综合征[12]，这可导致提前终止IFN治疗。研究报道，对一些恶性肿瘤如卡波济肉瘤患者，经IFN治疗产生的副作用比肿瘤对机体的损伤更严重。这也使IFN在临床的应用受到限制[13]。因此，迫切需要寻找一种安全高效获得干扰素的途径，改善和提高干扰素临床应用效果。EB 病毒( Epstein-Barr virus, EBV) 是一种人类γ疱疹病毒，可转化人外周血单个核细胞（PBMC），形成稳定增生的淋巴母样细胞系（LCLs），在肿瘤的发生发展中具有重要作用[14]。EBV感染可以引发单核细胞增多症，EBV与淋巴瘤、鼻咽癌、白血病及胃癌等-->恶性肿瘤的发生也有密切关系。EBV转化的B 淋巴细胞不同程度地表达9个与细胞内病毒潜伏感染有关的病毒蛋白，在这些潜伏蛋白中，膜蛋白1（LMP1）的作用最为重要，是EBV转化B淋巴细胞所必需的，经LMP1转化的淋巴细胞可促进自身增殖[15]。它是一个完整的膜蛋白分子，由胞浆区短N端、跨膜区和胞浆区长C端3个部分组成。胞浆区C端由200个氨基酸组成，其中后155个氨基酸是发生转化功能的基础，前44个氨基酸则维持已转化细胞的生长[16]。LMP1能够诱导EBV潜伏细胞产生大量干扰素，通过激活干扰素调节因子7（IRF-7），LMP1诱导多种IFN亚型的表达，发挥其生物学作用[17]。虽然利用LMP1转化人外周血细胞，经诱导可产生大量天然干扰素。然而，LMP1也是致癌基因，通过TRAF-TRADD信号传递，活化转录因子NF-κB、AP-1和JNK，从而调节细胞增殖和凋亡，达到细胞的恶性转化。我国刘海鹰等对LMP1进行基因改造，去除了LMP1 C末端的2个Nco I位点间的495bp的LMP1致癌性片段，发现其DNA疫苗可以在Balb/c纯系小鼠产生一定的CTL反应[18]。可见去除致癌性片段仍保留了LMP1的转化功能及免疫原性。我们利用病毒载体携带改造的LMP1转染患者自身的外周血B淋巴细胞，经诱导产生大量个体化的天然干扰素。所使用的是目前用于基因转移最常用的腺病毒载体，与其它病毒载体比较而言有许多优点，如安全性与稳定性好，宿主细胞种类广泛，可以感染非复制性细胞等。另外腺病毒载体在肿瘤基因治疗中本身可以作为佐剂，增强体液免疫和细胞免疫[19]。仙台病毒(Sendai virus, SeV)是1953 年在日本仙台的一次新生儿肺炎流行中首次分离出的单股负链RNA 病毒，可与其复制过程中形成的正链RNA退火后形成少量的双股RNA，后者再刺激淋巴细胞和巨噬细胞产生IFN。目前，常被用作IFN的诱生剂[20]。
技术实现思路
本专利技术提供一种个体化的天然干扰素的生成方法。具体的说，是用携带LMP-1突变体的病毒载体转化患者B淋巴细胞，再经诱生剂仙台病毒诱导生成。本专利技术涉及个体化的天然干扰素，具体的说，这种个体化的天然干扰素是来自需要干扰素治疗的患者外周血B淋巴细胞，具有天然的分子结构和更强的生物活性，可避免副作用的产生。本专利技术涉及个体化的天然干扰素的大量生成。具体地说，这种大量生成是通过腺病毒介导的LMP-1突变体转化人外周血B淋巴细胞，通过诱生剂仙台病毒诱导产生，其产出效率得到很大提高。本专利技术所涉及的病毒载体是腺病毒载体，携带的基因是改造的LMP1。具体地说，本专利技术通过PCR技术获得LMP-1的全长cDNA，再通过重叠PCR技术去除了LMP1C末端的2个Nco I位点间的495bp的致癌性片段，保留其转化活性，但缺失其致癌性。将缺失突变体插入腺病毒载体中，包装成重组腺病毒。本专利技术所涉及的干扰素诱生剂是仙台病毒，具体地说，是一种单股负链RNA 病毒。有益效果是：能高效发挥其抗肿瘤、抗病毒作用，同时避免了基因工程干扰素产生的副作用。应强调的是，本文下面结合优选具体实施例对本专利技术进行的叙述，上述说明以及-->下列实施例仅是用作举例说明，并不构成对本专利技术范围的限制。也就是说，凡利用LMP-1突变体转化B淋巴细胞，经诱导产生天然干扰素，均在本专利的范围。附图说明图1 是Western blot检测EBV转化不同人外周血B淋巴细胞后IFN-β的表达 。图2 是 ELISA检测EBV转化不同人外周血B淋巴细胞后IFN-α的表达。具体实施方式实施例1  淋巴细胞的血液采集和分离无菌状态下从人体静脉采集10-100ml外周血，然后将血液注入50ml离心管中，与等量的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）混合均匀。50ml离心管中加入Ficoll-Pague溶液，使其与PBS稀释的血液比率为1：2—1：4。然后将本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种大量生成个体化天然干扰素的方法，其特征在于：用携带ＥＢ病毒ＬＭＰ１突变体的病毒载体转染的Ｂ淋巴细胞，经诱生剂诱导后能生成大量天然干扰素。

【技术特征摘要】
1.一种大量生成个体化天然干扰素的方法，其特征在于：用携带EB病毒LMP1突变体的病毒载体转染的B淋巴细胞，经诱生剂诱导后能生成大量天然干扰素。2.如权利要求1所述的一种大量生成个体化天然干扰素的方法，其特征在于，所述的天然干扰素是利用EB病毒LMP1的缺失突变体，转染患者外周血B淋巴细胞产生的，具有天然的分子结构和生物活性。3.如权利要求1所述的一种大量生成个体化天然干扰素的方法，其特征在于，所述的LMP1突变体是将EB病毒LMP1的C末端的2个Nco I位点间的495bp的LMP1致癌性片段缺失突变，突变后的LMP1保持了其转化B淋巴细胞为淋巴母细胞的能力。4. 如权利要求1所述的一种大量生成个体...

【专利技术属性】
技术研发人员：许东升，
申请(专利权)人：许东升，
类型：发明
国别省市：32