本发明专利技术公开了一种诱导产生Ⅲ型干扰素-λ1的方法。用合适浓度的原核表达纯化的人白介素-32作为诱导剂，在以人外周血单个核细胞或其衍生的细胞系的细胞模型中，诱导表达干扰素-λ1。刺激适当的时间后，该细胞的培养体系中会快速地、特异性地表达产生大量的具有生物学活性的干扰素-λ1。所产生的天然干扰素具有广谱抗病毒活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种诱导产生III型干扰素- λ ι的方法，属于生物医药
技术介绍
III型干扰素(IFN)是最近发现和报道的一种新的干扰素家族，具有和I、II型干扰素类似的生物学活性。IFN-λ 1是III型干扰素的一种，基因位于人类19号染色体，转录得到的mRNA长度为856bp，开放式阅读框为长60;3bp。IFN- λ 1通过作用于细胞表面受体发挥其生物学活性。IFN-λΙ的受体由两条链构成，第一条链(IFNLRl)是IFNX特异的，第二条链(IL10R2)是IL-IO、IL-22和IL46受体共有的。IFN-λ s结合其受体后，主要激活JAK/ STAT通路。IFN- λ 1与受体复合物结合形成三聚体使得Janus激酶(Jakl和Jak2)活化， 随后IFN-λ Rl I⑶酪氨酸磷酸化，激活潜在的转录因子(STAT1和STAT2)。最终启动下游功能基因如2，，5，-OAS 1/2, MxA和PKR等的表达。IFN- λ 1的生物学功能主要包括三个方面第一，抗病毒活性。研究证明，IFN-λ 1 具有广谱的抗病毒效果，对多种病毒的表达和复制有明显的抑制作用，报道的病毒类型有， 乙型肝炎病毒(HBV)单纯疱疹病毒-2 (HSV-2)西尼罗河病毒和丙型肝炎病毒(HCV)水疱性口炎病毒(VSV)甲型流感病毒(IAV)和汉坦病毒(HTNV)。IFN-λ 1还能降低多种病毒的复制或病毒感染引起的细胞病变效应。第二，IFN-λ s具有抗增殖活性和抗肿瘤作用，IFN-λ 1 能够激活宿主抗肿瘤机制以抑制某些种类的肿瘤的生长。第三，免疫调节活性。IFN-λ 1免疫调节功能包括增加NK细胞和T细胞毒性，促进Thl反应，上调肿瘤细胞中的MHC I分子而促进抗原呈递以及介导细胞凋亡。因此，I型干扰素如IFN-α、IFN-β等在临床上的应用已经非常广泛，而作为一种新发现的干扰素，IFN-λ 1在临床上的应用还未完全推广。基于 IFN-λ 1具有和I型干扰素相似的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，但却通过不同受体起作用，因此IFN-λ 1可作为除I型干扰素外另一治疗选择。且最近的研究表明IFN-λ 1没有明显的免疫介导作用，与I型干扰素相比引起的毒负所用更小。因此，IFN-λ 1在临床上的具有非常广阔的应用前景。IFN-λ 1主要是在病原微生物感染时在宿主的免疫反应过程中被诱导表达。人类的IFN-λ 1并非组成型表达的，通常情况下该基因是不表达的。单链RNA病毒如甲型流感、 仙台病毒、新城疫病毒和双链DNA病毒都能诱导IFN-λ 1基因表达；细菌感染时，细菌的脂多糖也能诱导机体的免疫细胞表达该基因；最近的研究显示屋尘螨抗原刺激的原代支气管上皮细胞所产生的IFN-λ 1水平与病毒诱导的相当。目前在体外产生IFN-λ 1的技术方法主要是原核表达。即利用分子生物学技术克隆IFN-λ 1基因编码序列，构建到原核表达载体，在原核细胞内进行表达。用病源微生物诱导细胞表达IFN-λ 1，提取细胞总mRNA，逆转录PCR成cDNA，用设计好的特异性引物进行 PCR扩增，得到该基因的编码区基因序列，构建到原核表达载体中，用原核生物进行表达。例如，将构建好的原核表达质粒转化进大肠杆菌，然后大量培养该细菌，用原核表达的诱导剂如IPTG诱导，细菌即可表达产生IFN-λ 1。该方法的优点是，细菌培养的设备简单、成本低，可大量表达IFN-λ 1。但有无法避免的诸多缺点一、细菌表达的蛋白分子存在于细菌的细胞内，要想得到表达的蛋白必须破细胞，细胞裂解液中存在全部的细菌自身蛋白，要从这种混合物中分离纯化才能得到较为纯净的目的蛋白；二、为了分离纯化的需要，表达的分子必须融合进标签序列，即表达出来的蛋白是目的蛋白加标签的组合体，这种标签会影响产物的生物学活性；三、因原核生物与真核生物基因表达系统和机制的不同，会导致表达的产物产生错误折叠、错误修饰等直接影响产物的生物学活性，甚至完全没有生物学活性。目前，在真核细胞中诱导表达IFN-λ 1的方法非常少，且有很大的局限性。利用病源微生物或病源微生物的某一组分诱导细胞系或原代细胞可表达产生IFN-λ 1。例如，从血液中分离出单核细胞，用人源重组的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4 (IL-4)刺激其分化为成熟的树突状细胞(DC)，再用A型流感病毒感染该细胞，被病毒感染的DC细胞会表达产生IFN-λ 1。用细菌的脂多糖(LPS)或模拟病毒双链RNA的Poly I:C 刺激免疫细胞，如DC或PBMC，也可产生IFN- λ 1.该方法可产生具有完整生物学活性的 IFN-λ 1，其缺点是:Α、因需利用病源微生物或其致病成分作为诱导因素，应用过程中存在危险因素；B、该技术中被感染或刺激的细胞会产生复杂的天然免疫反应和炎症反应，甚至发生凋亡，细胞在病理过程中其它的细胞因子也开始了大量表达，如肿瘤致死因子-α (TNF-α )、IFN-α、IFN-β、白介素-18 (IL-18), IFN-γ等，产生大量的杂副产物，增加了该技术的应用难度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种在真核细胞中诱导表达IFN-λ 1的方法， 产物与现有技术相比更为较纯净。为了实现上述任务，本专利技术采用以下技术方案以表达纯化的人源重组白介素-32蛋白作为诱导剂，刺激人外周血单个核细胞或其衍生的细胞系用于产生干扰素-λ 1。更具体地，从全血或血液利用后的废弃组分中分离得到人外周血单个核细胞，并对其在体外进行培养；构建IL-32原核表达质粒，并诱导表达、纯化、去内毒素；在人外周血单个核细胞培养体系中加入表达纯化的人源重组白介素-32，刺激PBMC大量表达IFN-λ 1并分泌到细胞外的培养基中。作为优选的方案，IL-32蛋白的浓度在5ng/ml之上； IL-32蛋白刺激PBMC的时间在M小时之上。从血液利用后的废弃组分中分离得到人外周血单个核细胞的过程如下利用PBMC与血液废弃组分中其他成分(血小板、红细胞等)的密度不同，采用商用的人淋巴细胞分离液，用离心沉降的方法，从全血中将PBMC分离出来并洗涤。IL-32原核表达载体的构建、诱导表达、纯化过程如下设计特异性的引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，将IL-32的编码序列构建到商用的原核表达载体petjSa中；将原核表达质粒转化进大肠杆菌，用IPTG诱导表达IL-32.裂解细菌后，利用商用M柱纯化，得到较为纯净的人源重组IL-32 ；利用商用去内毒素试剂， 除去内毒素；人源重组IL-32大小为15-27 kD,利用规格为10 kD和50 kD超滤管进行进一步的纯化，得到纯净的人源重组IL-32 (图2)。本专利技术在PBMC的体外培养体系中分别加入浓度分别为1、5、10 ng/ml (质量体积比)的人源重组IL-32，继续培养M小时后，在收集到的PBMC培养基上清液中，我们采用酶联免疫反应的方法利用商业化的IFN-λ 1检测试剂盒，对诱导产生的IFN-λ 1蛋白绝对含量进行检测，人源重组的IL-32浓度为5ng/ml (质量体积比)诱导M小时后，PBMC上清中IFN-λ 1含量高达160pg/ml (质量体积比)(图5)。诱导方法的特异性和效率检测。将本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱应，吴建国，李永奎，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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