本发明专利技术涉及一种长效重组人干扰素及其表达纯化方法、重组表达工程菌的构建，具体讲，涉及一种经过点突变的长效重组人干扰素，以及其表达纯化方法和重组表达工程菌的构建。所述的长效重组人干扰素具有SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2或SEQ?ID?NO：3所示的任一氨基酸序列，编码长效重组人干扰素的核苷酸具有SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5或SEQ?IDNO：6所示的核苷酸序列。本发明专利技术的长效重组人干扰素具有稳定性强，对人血清蛋白酶的抵抗性强的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种长效重组人干扰素及其表达纯化方法、重组表达工程菌的构建，具体讲，涉及一种经过点突变的长效重组人干扰素，以及其表达纯化方法和重组表达工程菌的构建。
技术介绍
根据干扰素(interferons，IFNs)的定义，干扰素是一类至少在同种细胞上具有广谱抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节活性和在不同途径上影响细胞的代谢、生长和分化的蛋白质，其活性的发挥需新合成RNA和蛋白质，它是一类重要的细胞因子。经过近半个世纪的基础和临床研究，说明它是一种重要的广谱抗病毒、抗肿瘤治疗药物。干扰素首先与特异性细胞受体结合，通过信号传递，激活细胞基因表达，从而发挥干扰素的生物学活性：1.抗病毒活性：抑制病毒基因的复制。2.抗细胞增殖活性：细胞膜的改变；细胞骨架的改变；刺激细胞分化；调节生长因子的表达；抑制癌基因的表达；逆转恶化细胞的表型；激活p53基因的表达。3.免疫调节活性：诱导其它细胞素的表达；激活巨噬细胞、NK细胞；上调HLA I和II的表达；调节肿瘤相关抗原的表达。迄今所知，人干扰素存在多个型别：干扰素-a，b，d，g，e，k，l，t，w，limitin等型别，它们的主要特点和可能的临床应用各异。目前，研究较多并用于临床治疗的有a、b、g，其它型别干扰素是否有临床应用价值尚在研究之中。干扰素-a，属I型干扰素，约有23个变种，较详细研究的有约13种亚型。分子量为19-26kDa，由156-166个氨基酸组成，115-151之间为保守序列。基因集中在9p22，受体基因位于21q22.1。世界上批准用于治疗病毒病和恶性肿瘤的主要干扰素-a有：干扰素-a1b、a2b、a2a.，治疗约40种适应症，包括我国将干扰素-a2b列为预防SARS的储备药物之一。干扰素在机体内的清除速率在人和动物都研究得比较详细，动物实验的资料与人体试验大致上相似。干扰素的活性有相对的种属特异性，但是干扰素的药物动力学，不同动物获得的结果却无明显的差别。干扰素是一种蛋白质，口服以后一般为蛋白酶类所破坏。Schafer等(1972)证明，新生的小白鼠口服外源性鼠干扰素之后，在血流中可以发现干扰素，并且可以抵抗VSV的攻击。新生小鼠口服兔干扰素，也可以在血流中测出兔干扰素的存在。说明血流中存在的干扰素并非由于干扰素制剂中混有其他物质而诱生的小白鼠干扰素，而确是口服后进入血流的。8日龄小白鼠也获得同样结果。但是，成熟小白鼠口服干扰素后，在血流中不能发现干扰素。这些结果为新生儿口服干扰素防治新生儿病毒性疾病提供了基础。Emisphere公司的Eligen技术正在研究将人生长因子(与干扰素的大小相似)口服的研究。-->据Merigan(1975)报告，志愿者鼻腔接种干扰素后，在呼吸道可以维持17小时左右。Harmon等(1976)证明不少正常人的鼻分泌液中含有一种人成纤维细胞干扰素的抑制剂，但是这一抑制剂对白细胞干扰素无作用。Johnson等(1976)用10只猩猩和3名志愿者做的试验表明，在鼻腔局部应用人白细胞干扰素后(10000单位/0.01毫升滴鼻前庭)，除个别外都能保存，但是1小时后减少了5～50倍，说明局部应用的干扰素可被局部的黏液流所清除。小白鼠干扰素静脉注射小白鼠后，血流中的干扰素浓度很快下降，1小时仅为原始剂量的1/30，半衰期为11分钟(Baron et al 1966)；或1小时仅为原始剂量的1/16，半衰期为19分钟(Finter 1966)。Gresser et al(1967)静脉注射小白鼠128000单位干扰素，1分钟后血清中保存3840单位/毫升，1小时后仅80单位/毫升，半衰期为7分钟。Ho等(1967)给1公斤重家兔静脉注射100000单位干扰素，在11分钟之内血流干扰素就下降一半。Bocci等(1967)于700克家兔静脉注射17500单位干扰素，发现其半衰期仅2～4分钟。静脉注射后干扰素的清除速度与注射量有关，注射3×105单位干扰素时6小时消失，注射3×106单位，12小时消失；注射3×107单位，36小时消失。干扰素制品的纯度对静脉注射干扰素的清除无影响(Cantell et al 1976)。肌肉注射干扰素后在血流中干扰素维持的时间比静脉注射要长。Cantell等报道(1973)，人白细胞干扰素3×106单位或者家兔干扰素肌肉注射家兔后，在12小时内血清中可以维持相对稳定的干扰素水平。高剂量可以使干扰素的水平上升，并延长血清中干扰素持续时间。1次肌肉注射30×106单位人干扰素后48小时，血清中尚可测出一定量的干扰素(40单位左右)。干扰素制品的纯度可以影响于肌肉注射后干扰素进入血流的速度(Cantell etal1975)。人体肌肉注射106单位人白细胞干扰素后，血清干扰素高峰(～100单位/毫升)在2小时后形成，在大约6小时内完全稳定，24小时后仍可以测出低水平的干扰素(Emodi al1975)。皮下注射的结果与肌肉注射相似。Ho等(1974)证明，在兔脑池内或脑室内注射干扰素24小时后，脑脊髓液中干扰素量可为开始时干扰素量的1％～5％，说明干扰素在脑脊髓液中的消失要比血流中慢得多。DeClercq等(1975)报道，人脑脊髓内注射6×105单位干扰素后12～24小时，脑脊髓液中可保持相当高的干扰素量(800～8000单位/毫升)，这相当于注射时干扰素量的0.13％～1.3％，而血清干扰素的水平比脑脊髓液低40～80倍。近几年来许多蛋白质药物，包括干扰素，经过PEG化，或与人白蛋白连接后，延长干扰素在血液中的浓度，每周或每月注射一次即可，深受患者的欢迎。
技术实现思路
本专利技术要解决的首要技术问题在于提出一种长效重组人干扰素。本专利技术要解决的第二个技术问题在于提出编码这种长效重组人干扰素的核苷酸序列。本专利技术要解决的第三个技术问题在于提出表达本专利技术干扰素的重组表达工程菌。本专利技术要解决的第四个技术问题在于提出本专利技术的长效重组人干扰素的表达和纯化方法。为了完成本专利技术的目的，本专利技术采用的技术方案为：-->本专利技术涉及一种长效重组人干扰素，所述的长效重组人干扰素具有SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3所示的任一氨基酸序列。本专利技术还涉及编码该长效重组人干扰素的核苷酸序列。其中，本专利技术的第一个优选方案为所述核苷酸序列具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。本专利技术的第二个优选方案为，所述核苷酸序列以重组人干扰素α2b为模板，将编码第50位赖氨酸和126位精氨酸的核苷酸进行点突变：将编码第50位赖氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，构建SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；将编码126位精氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，构建SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或将编码第50位赖氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，并将编码126位精氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，构建SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。本专利技术的第三个优选方案为：针对将编码第50位赖氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸的引物序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示；针对编码126位精氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种长效重组人干扰素，其特征在于，所述的长效重组人干扰素具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示的任一氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种长效重组人干扰素，其特征在于，所述的长效重组人干扰素具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的任一氨基酸序列。2.一种编码权利要求1所述的长效重组人干扰素的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列以长效重组人干扰素-α2 b为模板，针对编码第50位赖氨酸和126位精氨酸的核苷酸设计引物，将编码第50位赖氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，构建SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；将编码126位精氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，构建SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或将编码第50位赖氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，并将编码126位精氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸，构建SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的针对将编码第50位赖氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸的引物序列如SEQID NO：7、SEQ ID NO：8所示；所述的针对编码126位精氨酸的核苷酸突变为编码组氨酸的核苷酸的引物序列如SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10所示。6.一种重组表达工程菌，其特征在于，所述的重组表达工程菌中含有权利要求3所述的核苷酸序列。7.根据权利要求6所述的重组表达工程菌，其特征在于，所述重组表达工程菌的构建方法为，将目的基因片段经过点突变，得到重组表达载体pBV220/rhuIFNa2b，将重组表达载体pBV220/rhuIFNa2b转化进入大肠杆菌DH5a，构建得到重组...
【专利技术属性】
技术研发人员：高寒春，侯云德，
申请(专利权)人：北京金迪克生物技术研究所，北京远策药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11
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