本发明专利技术属于分子生物学、基因工程技术领域，具体为一种在蝴蝶兰中表达的与成花相关的FVE基因的编码序列及其在调控植物花期上的应用。本发明专利技术涉及包含上述基因的重组植物表达载体及应用此载体转化获得的转基因植物。应用本发明专利技术涉及基因在植物中转化表达，转基因植物的开花时间将会有一定程度的延迟。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学、基因工程及植物生理学等领域，具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的成花相关基因/的克隆，包括此基因序列的分析，基因表达模式的分析，目的基因表达载体的构建，植物转化，转基因植株的获得以及相应的生理特性的鉴定。
技术介绍
成花过程是植物发育的核心，蝴蝶兰虽然具有较好经济价值和观赏价值，并深受国内外消费者的喜爱，但其成花需要电力降温或高山催花，这就大大提高了其生产成本。因此，很多学者就尝试通过基因工程手段调控蝴蝶兰花期，以降低生产成本。近年来，成功克隆的蝴蝶兰成花相关的基因有-.pchs (韩颖颖等，2005)，/%<^Z/T Uhang等，2010),/ ^^ Uhang等，2010)，/^°7P7 (Fu等，2010)等。但是，有关蝴蝶兰/万基因的研究还尚未见报道。本专利技术研究了一种从蝴蝶兰中克隆出来的与成花相关的FVE基因，转入拟南芥后引起花期推迟。而在本专利技术公布之前尚未有公开或报道过本专利技术申请中提及的蝴蝶兰厂防基因的核苷酸序列及其在转基因植株中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从蝴蝶兰中克隆出来的与成花相关的FVE基因，以及利用该基因在调控植物花期上的应用。本专利技术一方面提供了一个新的蝴蝶兰基因FVE，该基因与蝴蝶兰的成花有关。FVE 编码区全长1834bp，包含一个1407bp的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本专利技术的另一方面提供了上述FVE基因编码的蛋白质分子，该蛋白质分子具有 SEQ ID NO. 2所示的氨基酸编码序列。本专利技术还提供了用于调取获得蝴蝶兰样品中FVE基因的核苷酸引物序列，根据厂防基因保守区设计了一系列的RACE引物和RT-PCR引物，具体引物序列如SEQ ID NO. 3所示。本专利技术还提供了一种利用转基因技术将蝴蝶兰FVE基因的核苷酸编码序列SEQ IDN0. 1转入拟南芥以改变开花时间的方法，具体步骤如下(1)将蝴蝶兰厂防基因的开放阅读框连接入植物表达载体，形成含有蝴蝶兰FVE基因的植物表达载体；(2 )将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，用含有表达载体的农杆菌菌液浸泡拟南芥花序30s，黑暗培养过夜，第二天正常培养，约2周后收集转基因种子；(3)通过对拟南芥种子抗生素筛选，PCR鉴定，获得再生转基因植株，开花时间比野生型拟南芥推迟。本专利技术还提供了一种用于检测样品中是否存在蝴蝶兰FVE基因的核苷酸序列SEQ ID NO. 1的方法，使用SEQ ID NO. 4的核苷酸序列对转基因拟南芥DNA进行PCR扩增，然后电泳检测目的片段的有无。附图内容附图说明图1为以蝴蝶兰的花梗为材料提取的总RNA，含有较多杂质。图2为用DNase I消化后的结果，RNA的纯度明显提高。图3为3’ RACE扩增结果，约500bp。图4为5’ RACE扩增结果，由于引物的特异性不高出现非特异性扩增，割取上面的条带回收，连接转化，克隆测序可得到正确的序列，长约1400bp。图5为/^ ■基因最大的开放阅读框，长约1500bp，并以此对引物扩增转基因植株的 DNA,检测FVE基因是否表达的结果。具体实施例方式下面结合具体实施实例进一步阐述本专利技术。应理解，这些实例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 如Sambrook. J.等主编的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1蝴蝶兰厂防基因的克隆1.以蝴蝶兰itoritemoAsh ‘Tinny Tender’为实验材料，植物材料在光照培养箱内正常生长(L/D :16h/8h,25°C /19°C)。2.总 RNA 提取(1)取蝴蝶兰的花梗IOOmg左右，液氮充分研磨。(2)将粉末移入装有Iml Trizol Reagent (购自hvitrogen公司)的离心管，涡旋混勻，室温静置5min。(3)加入0. 2ml氯仿，剧烈振荡lmin，然后继续用力振荡lOmin，4°C，12000rpm离心 IOmin0(4)取上清，加等体积饱和酚(pH4. 5)，混勻，室温静置5min，4°C，12000rpm离心 IOmin0(5)取上清，加等体积氯仿异戊醇(对1)，混勻，室温静置5min，4°C，12000rpm 离心IOmin0(6)取上清，加等体积异丙醇，混勻，_70°C静置20min，4°C，12000rpm离心lOmin。(7)弃上清，加约Iml 75%酒精，温和震荡离心管，悬浮沉淀，4°C，7500rpm离心 5min。(8)弃上清，将沉淀风干，加入50 μ 1 DEPC H2O溶解总RNA，测浓度，电泳检测。3. DNA 消化用DNase I (购自TaKaRa公司)去除总RNA中的基因组DNA，方法参照试剂说明书进行。4.反转录采用MMLV反转录酶(购自Clontech公司)逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照实际说明书进行。45.基因克隆(1)3，RACE根据建立的cDNA文库中的已知片段设计上游特异性引物，以AP为引物反转录出的 cDNA为模板，依次使用3GSP1/AUAP和3GSP2/AUAP进行巢式PCR扩增，然后将扩增出的目的片段割胶回收，连接转化，克隆，测序。具体引物序列见SEQ ID NO. 3。(2) 5，RACE根据已知片段设计反转录特异性引物和下游引物，使用5GSP1/AAP进行第一轮PCR扩增，使用5GSP2/AUAP进行第二轮扩增，然后将扩增出的目的片段割胶回收，连接转化，克隆，测序。具体引物序列见SEQ ID NO. 3。(3)序列拼接根据得到的3’序列和5’序列，利用DNAMAN软件进行拼接，得到基因的序列全长。实施例2蝴蝶兰厂防基因表达载体的构建1.根据所得的基因全长，利用DNAMar软件查找基因的开放阅读框，以最大的开放阅读框作为目的片段构建表达载体。2.根据查找到的开放阅读框设计特异性引物，利用高保真酶I^rimeSTAR HS DNA Polymerase (购自TaKaRa公司)进行扩增，然后将扩增出的目的片段割胶回收，连接入 PMD20-T载体，转化，挑取阳性克隆，送3个样测序，比对测序结果直至3个序列完全一致。3.提取目的基因质粒，选用Xba I和Kpn I双酶切pMD20_目的基因重组质粒， pCAMBIA-1301质粒也采用相同的内切酶双酶切，使用T4DNA连接酶(购自NEB公司)将目的基因与pCAMBIA-1301连接，得到表达载体pCAMBIA-1301-目的基因，将其转化至DH5 σ，挑选单克隆，摇菌提取质粒，用相同的内切酶鉴定该重组质粒。4.将检测正确的重组质粒pCAMBIA-1301-目的基因电转化至农杆菌GV3101感受态细胞，挑选单克隆，摇菌提取质粒，将质粒重新转化至DH5 〃中，再重新提取质粒，酶切检测。挑选检测正确的菌液加甘油保存至70°C冰箱，以备转化拟南芥。实施例3 浸花法转化拟南芥1.种植拟南芥。培养条件为温度，湿度60%-80%，光照强度7000-9000LX，光照16h， 黑暗8h。2.转化菌液的培养。将转化了表达载体的农杆菌菌种划线活化，28°C培养2天， 挑选单克隆振荡培养1-2天，离心收集菌体，倒掉上清，加入70-80mL的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种蝴蝶兰成花相关的ＦＶＥ基因，其特征在于为具有特定序列的ＤＮＡ分子，长１８３４ｂｐ，具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种蝴蝶兰成花相关的/^ ■基因，其特征在于为具有特定序列的DNA分子，长 1834bp，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。2.一种如权利要求1所述的厂防基因编码的蛋白质分子，其特征在于具有SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸编码序列。3.用于调取获得蝴蝶兰样品中厂防基因的核苷酸引物序列，其特征在于如权利要求1 所述的厂防基因保守区设计的一系列的RACE引物和RT-PCR引物，具体引物序列如SEQ ID NO. 3所示。4.一种如权利要求1所述的蝴蝶兰厂防基因的核苷酸编码序列SEQ ID NO. 1转入拟南芥以改变...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔永一，孙小明，张迟，秦巧平，周明兵，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：86
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