本发明专利技术公开了基因GmEXPB2在提高大豆植株磷吸收效率方面的应用。本发明专利技术通过PCR方法，扩增出GmEXPB2基因的全长编码区，由强启动子35S驱动，连接到超量表达载体上，进行遗传转化，使其在转基因大豆中超量表达。在转基因大豆T3代和T4代植株中发现，GmEXPB2的过量表达提高了大豆获取低磷生长介质中磷的能力，进而增加了转基因大豆的生物量和磷吸收量。在低磷土壤中，两个独立的转基因株系的地上部和根部生物量较对照大豆分别增加了47.3％、30.5％和29.9、26.8％％；总根长和根表面积提高了39.2％、24.8％和40.8％、32.2％；磷吸收量提高了54.0％、41.3％。
Application of gene GmEXPB2 in improving phosphorus uptake efficiency of soybean plants
The invention discloses the application of gene GmEXPB2 in improving the phosphorus absorption efficiency of soybean plants. The whole coding region of the GmEXPB2 gene is amplified by the PCR method, and is driven by a strong promoter 35S, connected to an overexpression vector, and genetically transformed so as to overexpress the transgenic soybean. In the transgenic soybean T3 generation and T4 generation plants, the overexpression of GmEXPB2 enhanced the ability of soybean to obtain phosphorus in low phosphorus growth medium, and thus increased the biomass and phosphorus uptake of transgenic soybean. In low phosphorus soil, two independent transgenic lines of shoot and root biomass were increased by 47.3%, 30.5% and 29.9 26.8%%, compared with the control of soybean; total root length and root surface area were 39.2%, 24.8% and 40.8%, increased 32.2%; P uptake increased by 54%, 41.3%.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一个大豆的扩张蛋白基因在提高大豆植株磷吸收效率方面的应用。
技术介绍
大豆是重要的粮食、油料、饲料和能源兼用作物。在农业生产方面，作为具有生物固氮能力的豆科植物，大豆是一种优良的轮作换茬和间套作作物，具有培肥土壤、改良土壤结构、肥地养地，减少水土流失、增加土壤复种指数等显著的生态效应。目前，大豆作为油料作物的需求越来越大，国内大豆供求出现严重失衡。2000年中国年进口大豆突破1000万吨，成为世界上最大的大豆进口国。入世后，中国大豆的进口步伐加快，2003 - 2007年连续五年大豆进口量超过当年国内生产量，2005年进口量2500万吨，2007年进口量3500万吨。据预测我国大豆的需要量还会不断增长，在将来的5-10年内将达到每年4000-5000万吨(http: //www. jyqh. cn/article. php/24167)。因此，在我国发展大豆生产不仅关系到国计民生和粮食安全，还关系到我国社会经济建设和农业的持续发展。然而，大豆生产往往会受到许多生物和非生物胁迫的影响，产量很不稳定。尤其是在我国华南地区酸性红壤上，缺磷和铝毒是限制大豆生产的主要障碍因子(Liao et al, 2006)。磷是植物正常生长和发育的必需营养元素之一。然而，大部分土壤中植物可以直接吸收的无机磷有效性较低，并且有限的磷主要集中在耕层土壤中，随着土壤剖面深度的增加而降低(Lynch和Brown，1999)。植物根构型，即根系在三维生长介质中的空间分布，决定了植物根系所接触到的土壤体积的大小，因此与磷吸收效率密切相关。并且，植物对于土壤中的磷的吸收主要依靠根系吸收其周围所接触到的磷，植物根系在土壤有效磷含量相对较高的区域分布越多，根系接触到的土壤体积越大，越有利于根系对土壤中磷的吸收(严小龙等，2000)。Zhao等和刘灵等(2004和2008)的研究发现，浅根型大豆根系具有合理的三维空间分布，在土壤浅层根系分布较多，有利于对耕层土壤磷的吸收，从而显著提高了大豆的磷效率和产量。He等(2003)通过分层磷处理水稻根系，发现局部供磷促进了侧根分枝分化， 从而增加了根系接触土壤的面积，中上层局部供磷的水稻地上部生物量和吸磷量几乎与全层供磷相当。因此，通过转基因方法改变大豆植株根构型，让较多的根系分布在有效磷含量相对越高的耕层，是有效提高作物吸收利用土壤磷、解决限制大豆生产中缺磷问题的重要途径。目前的研究已发现多个调控磷高效根构型建成的关键新基因。其中，Lee等 (2003)在大豆上发现一个根系特异表达的α-扩张蛋白基因(βΒ￡ Ρ7)，在烟草的异源表达分析表明该基因可能与根的伸长有关。拟南芥上也报道了两个α-扩张蛋白基因和Ji^TWS的表达模式，发现它们是根毛特异表达的(Cho和Cosgrove，2002)。大麦编码扩张蛋白的HvEXPBI基因也是根部特异表达的，而且与根毛的形成有紧密联系 (Kwasniewski 和 Szarejko, 2006)。此外，在水稻(Shin 等，2005)和玉米(Wu 等， 2001)的根部也分别发现了 α-和β-扩张蛋白的特异表达。最近，Guo等(2011)在大豆上发现一个β-扩张蛋白基因(6fe￡i7^ )，其属于分泌蛋白，定位于细胞壁。实时荧光定量 PCR结果显示GmEXPB2在大豆的根部强表达，在花器官有低表达量，叶部则不表达。在拟南芥中异源表达GmEXPB2，结果显示在缺磷条件下，转基因植株的主根长、侧根长和侧根数目都显著增加，叶面积明显增大，开花期延迟。此外，似参与了根系对缺磷的适应性反应，在体内供磷不足的条件下，能刺激主根、侧根继续生长和侧根原基的形成，维持根系正常生长(Guo等，2011)。在大豆复合植株中过量表达和干涉似的结果表明，低磷条件下，其能显著促进转基因毛状根的生长(Guo等，2011)。有关转 化调控根构型建成的关键基因来改变转基因植株自身根系空间分布和构型，从而利用介质中有限的有效磷的报道并不多见。而将大豆本身的扩张蛋白基因在大豆中过量表达从而提高植株的磷吸收效率还未见报道。MGinEXPB2的研究尚停留在其表达模式和作用功能理论研究阶段，并无关于GmEXPB2在大豆整株中表达提高大豆植株对根际有限的土壤中有效态无机磷的吸收的技术方案的相关技术报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供基因GmEXPB2在提高大豆植株磷吸收效率方面的应用。本专利技术的另一个目的是提供所述基因SbETZ^ 在大豆植株中的表达方法。本专利技术的目的通过以下技术方案来予以实现本专利技术提供了基因在提高大豆植株磷吸收效率方面的应用。所述应用是在大豆中超量表达编码大豆β -扩张蛋白的新基因GmEXPB20所述β -扩张蛋白基因GmEXPB2参看Guo等(2011)的研究技术文献中描述。该基因全长cDNA为1048bp (EU362626)，编码227个氨基酸，分子量是29. 5KD。本专利技术通过 PCR方法，扩增出基因的编码区，由强启动子35S驱动，连接到超量表达载体上；再进行遗传转化，在大豆中超量表达这个基因，得到超量表达植株。在转基因T3和T4代植株中发现，转基因植株的吸磷量和生物量都显著高于阴性植株。本专利技术同时提供了实现所述应用的表达方法，具体包括以下步骤(1)以GmEXPB2的基因组片段作为应用基因，设计引物，扩增出基因的编码区， 由强启动子35S驱动，连接到超量表达载体上；(2)进行遗传转化，在大豆中超量表达所述基因，得到超量表达大豆植株。步骤(1)所述引物为 正向(左端)(5，-3，) AAAACCCGGGCTATCAACTACCTATAGGGAAC ； 反向(右端)引物(5’-3’) AAAATCTAGACCACAAGCTGATGATAGATCC。所述大豆品种优选粤春03-3。采用根癌农杆菌EHAlOl介导的大豆子叶节转化方法，在大豆品种粤春03-3中，超量表达基因，得到超量表达的大豆植株。 所述遗传转化包括以下步骤(1)种子消毒和种子萌发；(2)根癌农杆菌EHAlOl菌液制备；(3)外植体制备及转化程序；(4)侵染与共培养；(5)幼芽的诱导、伸长(6)幼芽生根，得到转基因单株Ttl代植株。选择超表达的植株，进行繁种，得到稳定的转基因后代株系。本专利技术构建 了过量表达载体，在大豆中超量表达了编码扩张蛋白的 GmEXPB2基因，转GmEXPB2基因植株显著提高了对土壤磷的吸收和利用，研究结果对培育磷高效大豆新品种具有重要的意义，在生产上具有较大的应用前景。本专利技术的有益效果概括如下(1)本专利技术提供了一种大豆的β-扩张蛋白基因^BfiiPi泛的新应用。本专利技术成功在大豆品种粤春03-3中超量表达编码β-扩张蛋白的基因后，试验证明，在低磷土壤中，两个独立的转基因株系的地上部和根部生物量较对照大豆分别增加了 47. 3%,30. 5% 和29.9,26.8%% ；总根长和根表面积提高了 39. 2%、24. 8%和40. 8%,32. 2% ；磷吸收量提高了 54. O0AAl. 3%。(2)通过本专利技术方法过量表达SbETZ^ 可以改变转基因大豆根系形态构型，在有效磷分布相对越多的耕层土壤中吸收更多的磷，提高磷的吸收效率，从而促本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．基因ＧｍＥＸＰＢ２在提高大豆植株磷吸收效率方面的应用，其特征在于是在大豆中超量表达编码大豆β－扩张蛋白的基因ＧｍＥＸＰＢ２实现；所述基因ＧｍＥＸＰＢ２编号为ＥＵ３６２６２６，基因全长ｃＤＮＡ为１０４８ｂｐ，编码２２７个氨基酸；所述超量表达是通过ＰＣＲ方法，以ＧｍＥＸＰＢ２的基因组片段作为应用基因，设计引物，扩增出ＧｍＥＸＰＢ２基因的全长编码区，由强启动子３５Ｓ驱动，连接到超量表达载体上，进行遗传转化；所述引物为：正向引物（５＇－３＇）：ＡＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＴＡＴＣＡＡＣＴＡＣＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＣ；反向引物（５＇－３＇）：ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＴＡＧＡＴＣＣ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王秀荣，廖红，谢建娜，严小龙，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81
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