本发明专利技术涉及一种在转基因植株中表达HaAK基因dsRNA的RNAi载体及其应用，属于农业生物技术领域。本发明专利技术提供了选用棉铃虫能量代谢关键酶基因——精氨酸激酶基因HaAK为RNAi的靶标基因来防治棉铃虫方法。本发明专利技术具体涉及一种在转基因植株中表达棉铃虫HaAK的dsRNA的RNAi载体及其在沉默目的基因中的应用。所述载体是由HaAK片段以正反两个方向插入植物表达载体中构建而成，在农杆菌的介导下，培育出表达HaAK基因的dsRNA的转基因植物。通过将转基因植株与野生型植株对比显示：取食这种转基因植物可影响棉铃虫的生长发育。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业生物
；更具体地，本专利技术具体涉及一种在转基因植株中表达棉铃虫Ha4K的双链RNA (dsRNA)的RNAi载体及其在沉默棉铃虫靶标基因中的应用。
技术介绍
在我国，目前对棉铃虫进行喷施杀虫剂仍然是主要防治手段。高毒高残留农药的滥施，不仅导致农作物产品质量下降，棉铃虫抗药性的增加，而且已危及人们的生命安全和健康。因此，生产上迫切需要发展安全、有效、新型的策略来控制害虫种群的危害。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指进化过程中，由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱导同源 mRNA 高效特异性降解的现象(Fire et al.，1998) ο 在线虫中通过喂养表达 dsRNA 的细菌(Kamath et al., 2001 ；Timmons et al.，2001)，或从溶液中吸食dsRNA (Tabara et al.，1998)，或者通过显微注射(Fire et al.，1998)，均能触发干扰基因表达沉默，且RNAi的表型至少可以遗传2代(Grishok et al.，2000)。dsRNA作为细胞内源性基因表达调节物通过降解mRNA发挥作用，已发展成为控制有害病原物的重要工具。近年来，利用转基因植物介导的抑制昆虫基因表达的RNAi技术迅速成为国内外研宄热点。Mao等(2007)分离了棉铃虫参与棉毒素(棉酚)解毒的P450基因。用表达相应dsRNA的转基因植物喂食后，棉铃虫P450基因的表达显著降低，对棉酚的耐受性大大减弱。再用含有棉酚的饲料或棉花叶片喂食，这些棉铃虫生长缓慢，甚至死亡。Baum等(2007)使用cDNA基因文库方法从玉米根虫中筛选出290个在昆虫生命活动中发挥必要生物功能的基因作为dsRNA的候选靶标，研宄结果表明最有效的是V型ATP酶(V_type ATPase)，其能够在极低的浓度(1.82ng/cm2)摄食24小时内快速引起根虫的特异RNAi沉默反应。通过对玉米进行遗传转化，获得转基因玉米，使其表达出以玉米根虫关键酶为靶标的dsRNA，结果表明，转基因玉米的根部遭受的破坏要比对照减少50% (Baum et al.，2007)。在植物中表达害虫关键功能基因的双链RNA，通过昆虫取食植物，将dsRNA传递到昆虫体内，能够特异地抑制昆虫防御基因的表达，使RNA干扰抗虫植物在农业生产中的应用成为可能。在昆虫中，那些编码重要蛋白的功能基因是RNAi很好的靶标。在植物中表达针对这些基因的双链RNA (dsRNA)，通过昆虫取食植物时，将双链RNA传递到昆虫体内，能够特异地抑制相应昆虫关键功能基因的表达，从而导致昆虫的生长和发育缺陷，甚至杀死昆虫。本专利技术克隆棉铃虫能量代谢的关键酶基因一一精氨酸激酶基因HaAK，以其为靶标基因，利用Gateway技术，以植物RNAi表达载体pANDAHK35为基础，构建出针对于靶标基因HaAK的植物遗传转化的RNAi载体，在农杆菌的介导下，培育出表达HaAK的dsRNA的转基因拟南芥，棉铃虫取食转基因拟南芥之后，对一龄幼虫致死率高达55%，对三龄幼虫的生长发育有明显的抑制作用，且取食转基因拟南芥后棉铃虫体内HaAK基因mRNA转录水平明显的低于对照。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对棉铃虫对农业作物严重的危害情况，提供选取棉铃虫能量代谢关键基因-精氨酸激酶基因HaAK为RNAi的靶标基因来防治棉铃虫。本专利技术的第一方面是提供一种在转基因植株中表达棉铃虫HaAK的dsRNA的RNAi载体。本专利技术的另一方面是提供基于针对HaAK靶标基因，利用植物介导的RNAi对棉铃虫幼虫生长发育的影响。本专利技术的技术方案在于采用一种在转基因植株中表达棉铃虫HaAK的dsRNA的RNAi载体，该载体是由HaAK片段以正反两个方向插入植物表达载体pANDA35HK中构建而成，其中两个HaAK基因片段之间包含一fgus linker fragment。所述的植物表达载体为pANDA35HK质粒；所述质粒载体包含植物筛选标记基因NPT-1I与HPT，所述的HaAK是棉铃虫的精氨酸激酶基因，其中，HaAK基因片段的正反向片段均为从棉铃虫中克隆获得的HaAK的全长cDNA序列。本专利技术的技术方案还在于采用一种含有棉铃虫HaAK基因RNAi载体的宿主细胞，所述的宿主细胞包括大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或者植物细胞。本专利技术的技术方案还在于采用一种棉铃虫HaAK基因RNAi载体在沉默靶标基因表达中的应用，从含有棉铃虫HaAK基因RNAi载体的大肠杆菌细胞提取质粒，然后转化农杆菌细胞，通过农杆菌侵染拟南芥，并最终获得转基因植株。通过将转基因植株与野生型植株进行对比，结果显示，棉铃虫取食转基因拟南芥之后，对一龄幼虫致死率高达55 %，对三龄幼虫的生长发育有明显的抑制作用，且取食转基因拟南芥后棉铃虫体内HaAK基因mRNA转录水平明显的低于对照。【附图说明】图1为质粒pANDA 35HK_dsHaAK的示意图。图2为转基因拟南芥植株的检测。图中，M表示是Marker ; I表示是对照植株；2_8表示是转基因阳性植株。图3为转基因植株表达HaAK dsRNA的Northern blot检测。I表示是对照植株；2-9表示是转基因阳性植株。Actin为内参基因。图4饲喂转基因植株对一龄棉铃虫幼虫的致死率。I龄棉铃虫幼虫，以正常的拟南芥为对照，以不同转基因株系AtdsHaAK-6，AtdsHaAK-8 and AtdsHaAK-1l为实验组饲喂1-3天对棉铃虫的致死率。图5饲喂转基因植株对三龄棉铃虫幼虫体重的影响。以正常的拟南芥为对照，以不同转基因株系AtdsHaAK-6，AtdsHaAK-8 and AtdsHaAK-1l为实验组饲喂3龄棉铃虫幼虫1-5天其体重的增加量的影响。 具体的实施方式实施例1，HaAK基因的克隆:(I)取棉铃虫1-2头，用TRIzol法提取总RNA ；(2)合成cDNA第一条链；(3)从棉铃虫转录组中获取基因片段序列，在NCBI数据库中进行同源性比对之后，根据其序列利用Primer premier 5.0软件设计F1/R1 ；(4)Fl:5' -ATGGTGGACGCCGCAACAAT-3'；(5)R1:5, -TTACAGCGACTTCTCAATT-3'。(6)以步骤⑵合成的棉铃虫cDNA第一条链为模板，以(4)、(5)中引物进行RT-PCR 扩增。RT-PCR 反应程序为:94°C 变性 5min ;35 个循环(94 °C lmin，56°C lmin，72 °C lmin) ；72 °C 1min。反应体系(25 μ L):10XEx PCR Buffer 2.5 yL,2.5mM dNTPMixture 2.0 μ L，10 μ M 上游引物 FlI μ L，10 μ M 下游引物 RlI μ L，cDNA 模板，2 μ L，5U/ μ LEx Taq 0.5 μ L? ddH20 16 μ L。(7)PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒回收纯化目的片段。(8)将步骤(7)回收纯化的目标片段与PMD18-T质粒相连接，反应体系如下:2XBuffer5.0 μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
选用昆虫能量代谢的关键酶基因——精氨酸激酶基因HaAK为RNAi的靶标基因来防治棉铃虫，其特征在于：选择棉铃虫HaAK基因作为RNAi的靶标基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘峰，赵伊英，汪小东，孙杰，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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