莲金属硫蛋白基因MT2a在提高种子寿命和活力上的应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学和生物技术领域，具体的讲涉及莲金属硫蛋白基因MT2a在提高植物种子寿命和活力上的应用。通过构建莲种子成熟后期胚轴cDNA文库，进行EST测序获得一个具有全长的莲金属硫蛋白基因，命名为MT2a，其在GenBank中的登录号为EF421200。进一步构建MT2a的正义过表达载体，转化模式植物拟南芥，结果表明转基因拟南芥种子比野生型种子具有更强的抵抗人工老化的能力和在氯化钠胁迫下的萌发活力。因此，如果将MT2a转入到水稻、小麦、玉米和大豆等重要农作物中，则可能提高重要农作物种子的贮藏寿命和活力。MT2a的应用可降低全球每年因为种子劣变和盐胁迫而造成的巨大农业损失，具有重要的经济效益和应用前景。

Application of lotus metallothionein gene MT2a in improving seed longevity and viability

The invention belongs to the field of molecular biology and biotechnology, in particular to the application of the lotus metallothionein gene MT2a in improving the longevity and vitality of plant seeds. A gene was obtained by EST sequencing of the cDNA Library of the late mature seed of lotus seed. A full-length metallothionein gene was named MT2a, and its accession number in GenBank was EF421200. To further build the justice of MT2a over expression vector into Arabidopsis plant, results showed that the transgenic seeds is stronger than wild type seeds of artificial aging and resistance in the germination under NaCl stress. Therefore, if MT2a is transferred to important crops such as rice, wheat, corn and soybeans, it may increase the storage life and vitality of important crop seeds. The application of MT2a can reduce huge agricultural losses caused by seed deterioration and salt stress worldwide, and has important economic benefits and application prospects.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和生物
，具体的讲涉及莲金属硫蛋白基因在提高植物种子寿命和活力上的应用。
技术介绍
种子是农业生产的根本。种子的寿命和活力对于植物繁殖、作物产量、种质资源保存和生物多样性起着决定性的影响。在长时间的贮藏后或者是逆境条件下，高质量的种子仍能够保持高的萌发率和长出健壮的幼苗。但是，随着贮藏时间的延长大部分的种子开始发生劣变，逐渐丧失活力，在萌发时对逆境变得越来越敏感，最终不能萌发。种子的劣变通常伴随着一系列的生理生化上的变化，如DNA的断裂、脂质的过氧化和蛋白的损伤等。 McDonald等认为，种子寿命受内在的遗传因子和外在的环境因素共同影响。尽管对于种子寿命和活力已经进行了大量的研究，但是对其确切的机理仍然不是十分清楚。人们普遍接受衰老的自由基氧化学说，并且活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)被认为是导致种子劣变的一个重要因子。为了应对由活性氧引起的氧化损伤，植物进化出了一套完整的抗氧化系统，包括酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统。抗氧化系统效率的高低通常影响着种子的寿命和活力。例如，2004年，Sattler等证明维生素E对于维持种子的寿命和活力起着至关重要的作用。而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶和抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化酶也被证明与种子的寿命和活力有关(Bailly等，1996， 2001 ；Lee 等，2010)。金属硫蛋白(Metallothionein^MTs)是生物界广泛存在的一类低分子量、富含巯基、能够结合重金属离子的蛋白质。金属硫蛋白在维持重金属离子稳态、重金属离子的解毒和运输、清除活性氧等方面发挥着重要作用(Cobbett and Goldsbrough，2002)。已有的研究表明，金属硫蛋白与动植物的衰老密切相关。Yang等(2006)证明转金属硫蛋白小鼠比未转基因小鼠具有更强的抵抗衰老诱导的氧化伤害的能力，因此表现出更长的寿命。在模式植物拟南芥中，绝大部分的金属硫蛋白基因在衰老的叶片和果荚中的表达大量上调(Guo 等，2003)。在秋天，山杨树衰老的叶子中金属硫蛋白基因会大量表达，而在幼叶中却不会 (Bhalerao等，2003)。除了与衰老有着密切的关系外，近年来的研究也表明金属硫蛋白在植物的抗逆过程中发挥中重要的作用。例如，旱稻在受到氯化钠或者聚乙二醇6000胁迫时，金属硫蛋白的表到量会大量上升(Wu等，2005 ；Yang等，2009)。Omutnbo nucifera Gaertn.)是地球幸存的冰期以前的古老植物之一。莲种子是经科学鉴定的最长寿和最耐高温的植物种子之一(Shen-Miller等，1995 ；黄上志等， 2003)。可见，莲种子为我们提供了挖掘控制种子寿命和活力基因的极佳遗传资源。鉴于以上所述，本专利技术通过构建莲种子成熟后期胚轴cDNA文库，进行EST测序后获得了一个全长莲金属硫蛋白基因，#rj a。进一步构建的正义过表达载体，转化模式植物拟南芥，结果表明转基因拟南芥种子较野生型种子具有更强的抵抗人工老化的能力和在氯化钠胁迫下的萌发活力。MT2a可以用于植物的遗传转化，提高植物种子的寿命和萌发活力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了莲金属硫蛋白基因在提高植物种子寿命和活力上的应用和在提高植物种子盐胁迫下的萌发活力方面的应用。本专利技术的另一目的为提供了一种编码如莲金属硫蛋白基因的氨基酸在提高植物种子寿命和活力上的应用和在提高植物种子盐胁迫下的萌发活力方面的应用。本专利技术通过以下技术方案实现的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的莲金属硫蛋白基因IUa在提高植物种子寿命和活力上的应用。氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的莲金属硫蛋白在提高植物种子寿命和活力上的应用。核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的莲金属硫蛋白基因IUa在提高植物种子盐胁迫下的萌发活力的应用。氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的莲金属硫蛋白在提高植物种子盐胁迫下的萌发活力的应用。本专利技术所述的莲金属硫蛋白基因是通过构建莲种子成熟后期胚轴cDNA文库，然后对文库进行EST测序后得到的。IUa在GenBank中的登录号为EF421200，开放读码框为243bp，5' -UTR为99bp，3' -UTR为357 bp，编码80个氨基酸。17为编码的蛋白与GenBank中欧洲山毛榉的MT2的序列一致性为74%，表明经过上述步骤得到的是编码莲金属硫蛋白的基因。根据获得的IUa的序列信息，设计添加了酶切位点Smal和5^1的引物，用PCR 的方法从构建的莲胚轴文库中扩增出的开放读码框片段，然后将PCR产物连接入 pGEMT-Easy载体，构建中间载体pGEMT_MT2a，转化大肠杆菌后，挑取单克隆测序鉴定。提取测序正确的克隆的质粒，用^k3I和feci酶切后回收小片段，连接入用同样酶消化的pBI121 大片段中，从而构建植物表达载体pBI121-MT2a。将构建好的载体转化大肠杆菌，挑取单克隆测序鉴定。提取测序正确的克隆的质粒，电击法转化根癌农杆菌EHA105，采用农杆菌介导的花序浸泡法转化Col-O型的野生拟南芥。通过卡那霉素筛选和叶片PCR鉴定，获得转基因的阳性植株。继续培养直到获得T3代的转基因纯合子。利用RT-PCR和Western Blot 证明双/为基因在转基因拟南芥种子中RNA水平和蛋白水平上都得到了大量表达。将筛选出的转基因种子和野生型种子，经过人工老化处理后，分别进行萌发实验和活力染色实验。萌发实验结果显示转基因种子的萌发速度和最终萌发率都远高于野生型种子，转基因幼苗的生长状况明显好于野生型幼苗。活力染色实验结果显示，人工老化处理后野生型种子大部分都丧失了活力，而转基因种子仍然保持较高的活力。上述结果表明为具有提高植物种子寿命和活力的能力。将转基因和野生型种子在含有150 mM的氯化钠的0. 5 MS固体培养基上萌发，结果显示转基因种子的萌发速度和最终萌发率都明显高于对照的野生型种子，表明MT2a能提高植物种子在盐胁迫下的萌发活力。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为(1)从莲中分离到了金属硫蛋白基因#72(3，通过转化模式植物拟南芥证实了能 提高植物种子的寿命和在盐胁迫下的萌发活力。(2) 将172 转入到水稻、小麦、玉米和大豆等重要农作物中，则可能提高重要农作物种子的贮藏寿命和活力。(3) MT2a的应用可降低全球每年因为种子劣变和盐胁迫而造成的巨大农业损失，具有重要的经济效益和应用前景。附图说明图1是植物表达载体pBI121_MI^a的示图。RB 右边界，LB 左边界。图2是转基因拟南芥种子的RT-PCR和Wfestern Blot检测结果。A为RT-PCR的检测结果，肌动蛋白2 (IiiM)是内参；B为flfestern Blot的检测结果，20kD是分子量大小。WT表示野生型。1、2、3分别是三个不同的转基因株系。图3是人工老化处理野生型和转基因拟南芥种子后的萌发结果图。横坐标是播种后天数，纵坐标是萌发率。■表示野生型，· ▲表示不同的转基因株系。图4是人工老化处理野生型和转基因拟南芥种子后的幼苗生长图。WT表示野生型。1、2、3分别是三个不同的转基因株系。图5是本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．莲金属硫蛋白基因ＭＴ２ａ在提高植物种子寿命和活力上的应用；所述的莲金属硫蛋白基因ＭＴ２ａ核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄上志，周玉亮，黎茵，楚璞，陈虎辉，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81