基于重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种基于重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体的检测方法。本发明专利技术检测方法是以重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞为凝集反应基质，重组表达的流感病毒血凝素和神经氨酸酶以凝集反应的方式检测待检样品中的流感病毒血凝素抗体和神经氨酸酶抗体。本发明专利技术方法将流感病毒血凝素和神经氨酸酶共表达在真核细胞表面，可以有效避免血凝素与细胞受体结合时发生自凝而影响凝集反应的效果，同时，本发明专利技术方法可以更广泛、快速地检测不同血清型的流感病毒抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于重组表达流感病毒血凝素和神经 氨酸酶的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体的检测方法。
技术介绍
特定血清型流感病毒感染、感染后恢复、隐性感染、以及疫苗接种的人或动 物，在其体液(如血清、支气管灌洗液、血浆、组织液等)中会出现流感病毒血凝素抗 体，通过检测特定血清型流感病毒的抗体，可以判断、诊断或确诊该人或该动物是否感 染(包括早期感染、隐性感染或感染后恢复等)该特定血清型的流感病毒、或接种过流感 病毒疫苗、或评价其对特定血清型流感病毒的抵抗力等。目前检测待检样品中是否存在某一特定血清型的流感病毒抗体的方法，主要有 血凝抑制实验(HAI)和中和实验，即将某一特定血清型的流感病毒先与待检样品混合， 然后加入红细胞或敏感细胞中，判断待检样品是否能够抑制该病毒的血凝反应或细胞病 变效应来进行判定，其缺点是需要使用具有感染性的病毒，安全性存在隐患。在涉及病 毒的实验中，根据国家有关法规(国务院《病原微生物实验室生物安全管理条例》、卫 生部《人间传染的病原微生物名录》、《人间传染的高致病性病原微生物实验室和实验 活动生物安全审批管理办法》)及WHO的规定与建议，包括人H2N2以及部分禽流感病 毒的操作要求在BSL-III (P3)实验室进行，因此，上述方法的开展对实验室条件要求很 高，不适用于现场检测和规模检测。文献也有报道，利用表达流感病毒HA的假病毒颗 粒来代替具有感染性的流感病毒进行HAI实验，但技术过于复杂。上述方法的缺点还在于只能检测流感病毒HA的抗体。流感病毒表面主要存在着 2种抗原性较强的糖蛋白刺突，即血凝素NA和神经氨酸酶NA，当流感病毒感染或隐性 感染或接种疫苗后，人或动物的机体会针对HA和NA都产生抗体，正是如此，流感病毒 中的甲型流感病毒根据HA的抗原性分为H1-H16等16个亚型，NA的抗原性分为N1-N9 等9个亚型，在甲型流感病毒中根据HA和NA亚型的不同组合方式形成了众多亚型，如 H5N1 (即H5亚型与Nl亚型组合)。因此，如检测流感病毒抗体，除需检测HA血清型 外，还需要对NA血清型进行检测。而目前对NA血清型抗体的检测则需要另行通过神 经氨酸酶酶活抑制的方法进行检测。除经典的HAI和中和实验外，也有用ELISA方法和乳胶凝集实验方法来进行检 测的报道。ELISA和乳胶凝集的优势在于可以检测HA和NA的抗体。其中，ELISA方 法是利用重组表达和纯化的流感病毒HA和/或NA来检测相应的抗体，这需要获保持抗 原特异性的重组蛋白的表达与纯化，且由于流感病毒有众多亚型，即使同种亚型的血清 交叉反应强度不一，对不同血清型的HA和NA抗原都进行重组蛋白的表达与纯化，其工 作量大、工艺要求高、批间稳定性差。乳胶凝集方法相对于现有的其它方法(HAI、中 和实验以及ELISA方法)而言，反应时间短、适合现场检测，但仍存在一些不足。乳胶凝集实验方法是将重组表达和纯化的流感病毒HA和/或NA蛋白偶联在惰性乳胶颗粒表 面，利用凝集反应进行检测流感病毒相应的抗体，这同样需要重组表达和纯化的流感病 毒HA和NA，并需要获得保持抗原特异性的重组蛋白的表达与纯化，如需要检测不同血 清型的流感病毒HA和NA抗体，就需要对不同毒株的HA和NA进行重组表达和纯化， 与ELISA方法一样，存在工作量大、工艺要求高、批间稳定性差等问题。由于检测流感病毒抗体对人或该动物是否感染(包括早期感染、隐性感染或感 染后恢复等)该特定血清型的流感病毒、或接种过流感病毒疫苗、或评价其对特定血清 型流感病毒的抵抗力等有重要意义，而目前的HAI、中和实验、ELISA以及乳胶凝集 等检测手段，或需要使用具有感染性的病毒，或需要特定的实验条件和设备，或工艺复 杂，或检测耗时长等缺点，因此，一种简便、快速、工艺相对简单易控的，可以同时检 测流感病毒HA和NA抗体检测方法具有广泛的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中用于检测流感病毒抗体的方法中存在的工艺 复杂、检测耗时长、稳定性差等问题，提供一种快速、简便、稳定性好的基于重组表达 流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体的检测方法。本方法上述目的通过以下技术方案予以实现本专利技术方法是将流感病毒血凝素基因和神经氨酸酶基因克隆后转染真核细胞， 使真核细胞表面重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白，与待检样品中的流感病毒 血凝素抗体和神经氨酸酶抗体结合，发生凝集反应，根据是否发生凝集反应来检测待检 样品中的流感病毒抗体具体地，本专利技术基于重组表达流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的真核 细胞凝集反应的流感病毒抗体检测方法，以重组表达流感病毒HA和NA的细胞为载体， NA可以破坏细胞表面HA的受体，防止细胞出现非特异性的自身凝集，同时利用细胞表 面重组表达的HA和NA的抗原性，通过凝集反应，检测待检样品中是否存在相应流感病 毒的抗体。流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中甲型流感病 毒的HA可以分为16个亚型、NA可以分为9个亚型，同时，由于流感病毒HA和NA的突 变和进化，即使是同一亚型的HA和NA，其交叉反应性的强弱不一。因此，检测某一特 定血清型流感病毒抗体时，使用本专利技术的方法，将重组表达该特定血清型毒株的HA的真 核细胞与待检样品进行凝集实验即可。上述的流感病毒HA，是指甲型流感病毒的HI、 H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15、H16 亚 型，以及乙型流感病毒、丙型流感病毒的血凝素，可以根据检测目的的需要使用某一特 定血清型的HA或其部分。上述的流感病毒NA，是指甲型流感病毒的Ni、N2、N3、 N4、N5、N6、N7、N8、N9亚型以及乙型流感病毒、丙型流感病毒的神经氨酸酶。上 述的重组表达流感病毒HA和NA可以是上述不同HA和NA的任一组合方式。作为一种优选方案，所述流感病毒血凝素抗体和神经氨酸酶抗体为tgG、IgM, IgA、IgE、IgD中的一种或几种的混合物。如是进行较广泛血清型的流感病毒抗体检测，则可以根据所检测的目的血清型毒株的HA和NA进行抗原性分析，选用抗原性保守或抗原交叉性强的HA和NA蛋白的 一部分进行重组表达真核细胞的构建，利用凝集反应对较广泛血清型的流感病毒抗体检 测。上述的流感病毒HA和NA，可以是某一流感病毒毒株HA和NA或其中一部分， 也可以是不同流感病毒毒株的HA和NA或其中一部分或不同HA和NA的拼接或混合， 也可以是对流感病毒HA和NA进行了突变和修饰，也可以是人工合成的天然不存在的序 列，但其核心是重组表达产物具有流感病毒HA和NA的抗原性。上述的重组表达流感病毒HA和NA的真核细胞，是指将编码有流感病毒HA和 NA的基因片段导入真核细胞，在真核细胞表面重组表达流感病毒的HA和NA。真核细 胞可以是酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞，以及其它的真核细胞，重组表达的流感病毒 HA和NA位于细胞膜或细胞壁表面。其中，真核细胞优选哺乳动物细胞和昆虫细胞， 其重组表达的流感病毒血凝素可以有更为接近病毒感染人或动物所获得翻译后修饰、空 间构型和抗原性，其与流感病毒相应抗体的反应特异性更佳。进一步，优选哺本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体的检测方法，其特征在于所述方法是将流感病毒血凝素基因和神经氨酸酶基因克隆后转染真核细胞，使真核细胞表面重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白，以此为凝集反应基质与待检样品中的流感病毒血凝素抗体和神经氨酸酶抗体结合，发生凝集反应，根据是否发生凝集反应来检测待检样品中的流感病毒抗体。

【技术特征摘要】
1.一种基于重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞凝集反应的流感病毒 抗体的检测方法，其特征在于所述方法是将流感病毒血凝素基因和神经氨酸酶基因克隆 后转染真核细胞，使真核细胞表面重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白，以此为 凝集反应基质与待检样品中的流感病毒血凝素抗体和神经氨酸酶抗体结合，发生凝集反 应，根据是否发生凝集反应来检测待检样品中的流感病毒抗体。2.根据权利要求1所述的基于重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞凝集 反应的流感病毒抗体的检测方法，其特征在于所述凝集反应基质为天然的重组表达流感 病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞，或者是经过胰酶处理、机械分散、酶解分散、固 定剂固定、稳定剂处理、防腐剂处理的方法同时或选择性处理后的重组表达流感病毒血 凝素和神经氨酸酶的真核细胞。3.根据权利要求1所述的基于重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞凝集 反应的流感病毒抗体的检测方法，其特征在于所述重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸 酶的真核细胞为同时共同重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶，或者分别重组表达流 感病毒血凝素的真核细胞与重组表达神经氨酸酶的真核细胞的混合。4.根据权利要求1所述的基于重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞凝集 反应的流感病毒抗体的检测方法，其特征在于所述真核细胞表面重组表达的流感病毒血 凝素和神经氨酸酶蛋白为完整全长的流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白，或流感病毒血 凝素蛋白和神经氨酸酶的一部分，或流感病毒血凝素和神经氨酸酶的抗原表位，或将流 感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白全长或部分肽段中的部分氨基酸进行突变或修饰，或者 是流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白与其它蛋白、多肽、肽段进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：王革非，李蕊，李康生，
申请(专利权)人：汕头大学医学院，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]