【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疾病诊断治疗领域，特别涉及一种模拟人类阿尔茨海默症tau蛋白聚集介导疾病发生、发展过程的方法。
技术介绍
1、阿尔茨海默症(ad)是一种起病隐匿的进行性发展的神经退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。
2、tau蛋白是机体神经元内正常存在的微管相关蛋白，主要功能是调节微管的组装和稳定，以及调节轴突运输。生理状态下，磷酸化的tau蛋白可以和微管结合，协助维持微管的稳定，在神经元的物质转运和信息传递之间发挥着重要的作用。然而过度磷酸化的tau蛋白则降低了和微管结合的能力，从而在细胞内异常的沉积并相互缠结，形成镜下可见的nfts。这种病理形式的tau在突触末端过度累积，从而破坏突触功能并导致突触退化。
3、最近的研究揭示脑内tau蛋白聚集的分子机制，为阿尔茨海默症的药物研发提供了新的靶点。
4、gal4-uas系统作为一种典型的双元表达系统，由两个部分组成：gal4基因(编码酵母转录激活蛋白gal4)和上游激活序列uas(upstream activation sequence,增强子)。如果使得gal4以组织特异性的方式激活与uas相连接的下游基因的转录，研究某个信号通路或某个基因在特定发育阶段或特定的组织器官中的功能就成为了可能。
5、因此，如何利用上述双元表达系统，建立阿尔茨海默症的神经退行性疾病模型，利于研究人员在细胞和亚细胞水平对疾病进展进行观察，是本领域技术人员亟待解决的问题。>
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种模拟人类阿尔茨海默症tau蛋白聚集介导疾病发生、发展过程的方法，其建模过程简单、材料成本低，利用斑马鱼huc启动子，在斑马鱼神经元细胞中高表达突变的人源tau蛋白，实现实时观察高度磷酸化tau介导阿尔茨海默病发生的时空表达特点的目的。
2、本专利技术的技术方案是：一种模拟人类阿尔茨海默症tau蛋白聚集介导疾病发生、发展过程的方法，包括以下步骤：
3、1)构建转基因表达载体
4、构建表达载体driver和responder，表达载体driver的序列为seq no.1，表达载体responder的序列为seq no.2，序列seq no.2中含有标签序列；
5、2)制备p0样本
6、将步骤1)得到的表达载体driver、表达载体responder、转座酶mrna同时注入斑马鱼胚胎中，得到p0样本；
7、3)筛选f0、f1样本
8、p0样本培育至性成熟，与野生型斑马鱼杂交，筛选出含有标签的胚胎，得到f0样本，培育至性成熟后自交，得到f1样本；
9、4)制备f2样本
10、f1样本培育至性成熟后与野生型斑马鱼杂交，得到稳定遗传的f2样本。
11、步骤1)基于tol2转座系统构建表达载体driver和responder，序列seq no.1中包含神经元特异性启动子huc，序列seq no.2中uas段两侧引入两个e1b启动子，所述标签序列为荧光基因egfp。
12、步骤1)表达载体driver的制备方法为：
13、1)取pgtag-gal4-vp16-b-actin载体，扩增其gal4-vp16序列；
14、2)线性化ptol2-huc(elavl3)-campari2载体；
15、3)将扩增的gal4-vp16序列连接到线性化的ptol2-huc(elavl3)-campari2载体上。
16、扩增gal4-vp16序列使用的引物gal4-f的序列为atattttccacctgcagataattaggatccggagccacgaacttctct，引物gal4-r的序列为aaaacgacggccaggatccaccggatcgatttacatatccagagcgcc，以pgtag-gal4-vp16-b-actin载体为模板进行pcr扩增。
17、步骤1)表达载体responder的制备方法为：
18、1)取prk5-egfp-tau p301l质粒，扩增其tau p301l序列；
19、2)线性化tol2-pa-gi-wt1bdnnterm-e1b-5xuas-e1b-egfp-gi-pa-tol2；gcryst:cfp载体；
20、3)将扩增的tau p301l序列连接到线性化的tol2-pa-gi-wt1bdnnterm-e1b-5xuas-e1b-egfp-gi-pa-tol2；gcryst:cfp载体上。
21、扩增tau p301l序列使用的引物tau-f的序列为ccacacgaattgatttaaattaatgatccgctgagccccgccaggag，引物tau-r的序列为cccgtggccgtatcttcgcagatcgatccagacatgataagataca，以prk5-egfp-tau p301l质粒为模板进行pcr扩增。
22、步骤2)表达载体driver、表达载体responder、转座酶mrna加入含有0.03％酚红的溶液中，浓度均为20ng/μl，斑马鱼胚胎的注射量为1.4nl。
23、本专利技术还提供了一种阿尔茨海默症斑马鱼模型，采用任一上述方法制备得到。
24、本专利技术还请求保护上述阿尔茨海默症斑马鱼模型在实时表现阿尔茨海默症发生、发展中的用途，可供研究人员模拟人类阿尔茨海默症中tau蛋白聚集介导疾病发生、发展过程。
25、采用上述技术方案具有以下有益效果：
26、1、本专利技术公开的建模方法，利用斑马鱼神经元特异性启动子huc介导gal4/uas诱导系统的表达，通过诱导人源tau p301l突变蛋白表达(该蛋白在第301个氨基酸位点发生突变)建立自发性ad转基因斑马鱼模型。在该模型中，gal4/uas系统可以对tau p301l的表达进行时空调节，便于对转基因斑马鱼的保种和传代，同时，用绿色荧光蛋白egfp示踪taup301l蛋白的表达，实时监测ad的发生、发展过程。
27、2、本专利技术公开的建模方法，构建的表达载体driver包含神经元特异性启动子huc，控制gal4-vp16融合蛋白的表达，进而有效地激活表达载体responder上的uas的蛋白表达。同时，在uas序列的两侧引入两个e1b启动子，一个方向驱动人类tau p301l的表达，另一个方向驱动荧光报告基因egfp的表达，以egfp示踪胚胎中tau p301l+的细胞。
28、3、本专利技术公开的建模方法，表达载体driver、表达载体responder、转座酶mrna同时注入斑马鱼胚胎中，转座酶mrna在胚胎细胞中可以催化这两种载体在短时间内随机整合到胚胎细胞亚群中，形成表达tau p301l和egfp的嵌合体胚胎。筛选出的f0样本在成熟神经本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种模拟人类阿尔茨海默症TAU蛋白聚集介导疾病发生、发展过程的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，步骤1)基于Tol2转座系统构建表达载体Driver和Responder，序列SEQ No.1中包含神经元特异性启动子huc，序列SEQ No.2中UAS段两侧引入两个E1b启动子，所述标签序列为荧光基因eGFP。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)表达载体Driver的制备方法为：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增Gal4-VP16序列使用的引物Gal4-F的序列为ATATTTTCCACCTGCAGATAATTAGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCT，引物Gal4-R的序列为AAAACGACGGCCAGGATCCACCGGATCGATTTACATATCCAGAGCGCC，以pGTag-Gal4-VP16-B-actin载体为模板进行PCR扩增。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)表达载体Responder的制备方法为：
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7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)表达载体Driver、表达载体Responder、转座酶mRNA加入含有0.03％酚红的溶液中，浓度均为20ng/μL，斑马鱼胚胎的注射量为1.4nL。
8.一种阿尔茨海默症斑马鱼模型，其特征在于，采用权利要求1-7任一方法制备得到。
9.权利要求8阿尔茨海默症斑马鱼模型在用于实时表现阿尔茨海默症发生、发展中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种模拟人类阿尔茨海默症tau蛋白聚集介导疾病发生、发展过程的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，步骤1)基于tol2转座系统构建表达载体driver和responder，序列seq no.1中包含神经元特异性启动子huc，序列seq no.2中uas段两侧引入两个e1b启动子，所述标签序列为荧光基因egfp。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)表达载体driver的制备方法为：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增gal4-vp16序列使用的引物gal4-f的序列为atattttccacctgcagataattaggatccggagccacgaacttctct，引物gal4-r的序列为aaaacgacggccaggatccaccggatcgatttacatatccagagcgcc，以pgtag-gal4-vp16-b-actin载体为模板进行pcr扩增。
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