【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测，具体涉及一种用于人运动神经元存活基因smn1拷贝数检测的引物探针组合及其应用。
技术介绍
1、脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，sma)是一种源于脊髓前角退变引起肌无力和肌萎缩的神经退行性疾病，属常染色体隐性遗传病。据相关报道，目前中国sma患者人数大约3-5万人。
2、sma的致病基因smn1(survival motor neuron l，ng_008691.1)位于染色体5q13.2，编码运动神经元存活蛋白smn。sma是由人体内两个拷贝(分别来自于父亲和母亲)的smn1基因都变异/缺失造成的。smn1是对运动神经元的存活至关重要的基因，它的缺失会导致控制肌肉的神经逐渐退化，肌肉萎缩，最终大部分会因为呼吸肌衰竭而死亡。人体基因组在smn1基因相距不远处存在一个高度同源的假基因smn2，呈镜像排列。smn2基因在编码区内与smn1基因只存在1个碱基的差异，即第7号外显子上的c.840c＞t。这一差异虽然为同义改变，但影响基因剪接的过程，结果导致该基因表达的～90％产物为截短片段并很快被降解，只有～10％产物为全长有功能的正常蛋白。
3、约96％的sma患者由smn1基因外显子7、8纯合缺失导致，或只存在外显子7纯合缺失。smn1基因两个拷贝的纯合缺失即可确诊sma。如果患者只有1个smn1拷贝，且临床表型与sma相符，则需对剩余的smn1基因进行测序，检测是否存在其他微小突变。近年来，随着对致病基因的深入研究，有效治疗方法业已面世但价格高昂。生育s
4、到目前为止，国内已有多家获批基于传统荧光定量pcr方法用于sma的辅助诊断，包括上海五色石、苏州天隆生物、深圳会众生物、深圳亚能生物。但定量检测时依赖于对照样本的ct对比计算，扩增效率要求一致～100％，对pcr抑制剂敏感，检测cnv(拷贝数变异)时由于ct差值很小误差控制要求很高。最早获批的上海五色石只能用于smn 1基因的纯合缺失检测，不能做到smn 1和smn 2基因拷贝数的精确定量；苏州天隆生物专利应用pcr-熔解曲线法，不同于主流的荧光探针法，不利于筛查推广；亚能生物的专利说明包含9对引物、15条探针，设计和解读过于复杂；深圳会众同时结合荧光定量分析smn 1和smn 2拷贝数和熔解曲线分析smn 1热点突变，含多条引物探针方法复杂也不利于推广。
5、除了常用的荧光定量pcr技术平台外，临床上常用的sma检测技术包括：聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性(pcr-rflp)，变性高效液相色谱分析(dhplc)技术、多重连接依赖性探针扩增(mlpa)技术、下一代测序(ngs)技术等。
6、pcr-rflp利用smn1和smn2基因序列差异带来的限制性酶(drai/hinfi)切片段长度的差异来检测smn1基因的纯合缺失。方法优点是简单可靠，缺点需要扩增后处理，要求抽提的dna质量高以保证酶切消化的完全，不能检测smn1杂合缺失和smn2拷贝数，也不能用于携带者检测。
7、目前，基于多重荧光定量pcr和多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,mlpa)检测smn基因的突变及拷贝数被视为金标准。优点是可用微量(少至20ng)dna同时多位点检测，可同时检测smn1和smn2基因的拷贝数。mlpa分析所需的毛细管测序仪价格昂贵，配套的进口试剂耗材价格高，导致国内医疗机构该检测平台的普及度不高；其次，mlpa操作步骤多、检测时间长、对技术人员的操作分析能力要求较高，在医疗资源紧缺的国内未受青睐。dhplc也可用于smn拷贝数检测，具有成本低、检测快速、通量高的优点。但实践应用中，dhplc需要特定设备，分辨率常受到实验设计、检测环境等诸多因素的影响，存在检测可靠性和稳定性欠佳的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足和实际需求，本专利技术的目的在于提供一种利用等位基因特异性扩增技术，在数字pcr平台上检测人运动神经元存活基因smn1拷贝数的试剂盒。
2、本专利技术中利用等位基因特异pcr(arms-pcr)与mgb探针相结合的检测方法检测sma基因分型。等位基因特异pcr(arms-pcr)又名突变阻滞扩增系统，其基本原理是在pcr引物3`末端的倒数第3个碱基进行错配设计，使得该引物只能扩增特异的突变snp位点，不能扩增野生型模板，从而检测特定基因型。
3、本项目中针对snp位点下游特异序列设计的mgb探针只能结合在特异的pcr扩增产物上。因此只有在arms-pcr引物在snp位点发生特异性扩增之后，mgb探针才能与相应的pcr产物相结合，产生荧光信号。本项目将arms-pcr方法的特异性扩增技术和mgb探针对模板的特异性结合技术结合在一起，极大地提高了snp位点检测的准确性。可有效避免smn2基因对smn1基因拷贝数检测的干扰。
4、数字pcr(digital polymerase chain reaction，dpcr)是一项针对单分子靶标dna的绝对定量技术。同传统pcr相比，数字pcr增加了一步分隔(partitioning)的操作，该技术是将含有dna模板的pcr溶液稀释后分布到大量的独立反应室(如芯片)。核酸模板在这种分割过程中被充分稀释，理想状态下每个微反应体系中至多含有1个分子的核酸模板。液体分子遵从泊松分布，单分子间通过稀释分离，并且独自进行pcr扩增，这种样品的分配可以极大降低本底信号的影响，提高低丰度靶标的扩增灵敏度，最后分析每个扩增产物，通过泊松概率分布公式计算出dna模板的原始拷贝数而不需要采用参考标准物或者外标。准确的定量依赖于40～45个循环的扩增，假阴性检出水平(单dna模板出现在反应室而未被检出)非常低。
5、本专利技术设计的引物的扩增效率高，探针的特异性强，在同一反应中同时扩增待测样本的靶基因smn1和内参基因gapdh，通过计算数字pcr平台上两者的阳性点个数的比值确定待测个体的smn1基因拷贝数，根据该比值的范围可有效检测出smn1基因纯合缺失、杂合缺失和野生型3种基因型。
6、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
7、第一方面，本专利技术提供一种用于人运动神经元存活基因smn1拷贝数检测的引物探针组合，具体是用于人运动神经元存活基因smn1基因外显子7和外显子8拷贝数检测的引物探针组合，所述用于人运动神经元存活基因smn1拷贝数检测的引物探针组合包括特异性扩增并检测人运动神经元存活基因smn1的引物对和探针；
8、特异性扩增所述人运动神经元存活基因smn1外显子7的引物对包括正向引物和反向引物；
9、所述正向引物包括seq id no.1所示的核苷酸序列；...
【技术保护点】
1.一种用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的引物探针组合，其特征在于，包括特异性扩增并检测人运动神经元存活基因SMN1的引物对和探针；
2.根据权利要求1所述的用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的引物探针组合，其特征在于，检测所述人运动神经元存活基因SMN1的探针包括SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示的核苷酸序列；
3.根据权利要求1或2所述的用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的引物探针组合，其特征在于，所述用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的引物探针组合还包括特异性扩增并检测内参基因GAPDH的引物对和探针；
4.一种用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的试剂盒，其特征在于，所述用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的试剂盒包括权利要求1～3中任一项所述的用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的引物探针组合、反应试剂和质控试剂；
5.根据权利要求4所述的用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的试剂盒，其特征在于，所述质控试剂包括SMN1零拷贝质控、SMN1单拷贝质控或
6.一种权利要求4或5所述的用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述待测DNA样品的浓度为5～100ng/μL；
8.根据权利要求6或7所述的使用方法，其特征在于，步骤(3)中，判断SMN1基因的拷贝数的标准包括：
9.一种用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的系统，其特征在于，所述用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的系统包括：
10.权利要求1～3中任一项所述的用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的引物探针组合、权利要求4或5所述的用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的试剂盒或权利要求9所述的用于人运动神经元存活基因SMN1拷贝数检测的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测人运动神经元存活基因SMN1拷贝数的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于人运动神经元存活基因smn1拷贝数检测的引物探针组合，其特征在于，包括特异性扩增并检测人运动神经元存活基因smn1的引物对和探针；
2.根据权利要求1所述的用于人运动神经元存活基因smn1拷贝数检测的引物探针组合，其特征在于，检测所述人运动神经元存活基因smn1的探针包括seq id no.5和seq idno.6所示的核苷酸序列；
3.根据权利要求1或2所述的用于人运动神经元存活基因smn1拷贝数检测的引物探针组合，其特征在于，所述用于人运动神经元存活基因smn1拷贝数检测的引物探针组合还包括特异性扩增并检测内参基因gapdh的引物对和探针；
4.一种用于人运动神经元存活基因smn1拷贝数检测的试剂盒，其特征在于，所述用于人运动神经元存活基因smn1拷贝数检测的试剂盒包括权利要求1～3中任一项所述的用于人运动神经元存活基因smn1拷贝数检测的引物探针组合、反应试剂和质控试剂；
5.根据权利要求4所述的用于人运动神经元存活基因smn1拷贝数检测的试剂盒，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦炜，邱耕，叶建明，彭丹芳，许连，向虹运，
申请(专利权)人：上海鉴研医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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