抑制bcr3/abl2和VEGF基因功能的反义核酸药物组合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抑制ｂｃｒ３／ａｂｌ２和ＶＥＧＦ基因功能的反义核酸药物组合物及其应用，以ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因和血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）为靶点，采用ｂｃｒ３／ａｂｌ２和ＶＥＧＦ基因反义寡核苷酸（ＡＳ－ＯＤＮｓ）联合作用于Ｋ５６２细胞系和Ｋ５６２移植瘤，提供在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的联合药物治疗和基因治疗的新用途，能增加白血病细胞对化疗药物的敏感性，减少化疗药物的用量，提高其临床疗效。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种反义核酸，尤其涉及针对慢性粒细胞白血病融合基因bcr3/abl2和血管内皮生长因子VEGF的反义核酸药物组合物及其在制备治疗白血病药物中的应用。
技术介绍
慢性粒细胞白血病(CML)是造血系统克隆性疾病，其特征性的Ph染色体和由此而形成的bcr/abl融合基因及其编码的蛋白质是CML的发病基础。现已证实在CML中，bcr/abl基因的表达可抑制CML细胞的凋亡，这是造成患者白血病克隆性增生的主要原因。VEGF作为一种主要的促血管形成因子，它与特异性受体结合，在体外能够诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，在体内能够促进血管新生。VEGF在实体瘤的发生、发展及转移过程其重要作用，最新研究发现恶性血液病细胞亦高表达VEGF蛋白，并不同程度表达VEGF受体，即VEGF和受体共表达现象，提示有VEGF自分泌机制存在。VEGF以自分泌方式作用与白血病细胞表面VEGF受体，促进白血病细胞增殖，维持白血病细胞存活，并且阻止放射线和化疗药物诱导的凋亡，增强白血病细胞的耐药性。VEGF及受体已成为血液恶性肿瘤治疗的理想靶点。最近文献报道，CML患者体内表达过量表达VEGF，骨髓微血管密度增加，且VEGF水平还可能影响疾病的预后。值得注意的是，肿瘤的发生发展是多因素作用的结果，涉及到多个基因，不同发展阶段的癌基因和抑癌基因的数目和种类各不相同，所以肿瘤的单基因治疗往往不能达到理想的目的。因此在治疗中选择两个或两个以上的目的基因进行有效联合，理论上应该具有更佳的效果。以bcg3/abl2和VEGF为靶点药物中，最有应用前景的可能是反义核酸药物，因为它可以直接、特异性地封闭某种基因的表达，并且少有毒副作用，价格适宜，与化疗药物联合应用，可能会降低耐药性，减少毒副作用，提高缓解率，改善预后，甚至达到根治效果。已有研究报道18-26个核苷酸的反义寡核苷酸能降低bcr/ablmRNA水平和P210蛋白表达，在体外抑制CML细胞和细胞系的生长，恢复细胞对凋亡刺激的敏感性(ClarkRE.Leukemia，2000，14347-355)。在实体肿瘤治疗中，国内外不同实验小组应用VEGF反义寡核苷酸能够抑制血管新生，延缓肿瘤生长。何睿等利用反义VEGF片段转染K562细胞，观察到细胞生长受抑，裸鼠肿瘤生长缓慢，凋亡增加(Rui He，Bin Liu，Chen Yang，et al.CancerGene Therapy，2003，10879-886)。Tomasz Skorski报道了磷酸化的bcr/abl和C-myc反义寡核苷酸单独和联合应用在体内对SCID鼠白血病进展的作用，结果显示，联合治疗的白血病鼠疾病进展延迟，生存期明显延长，表明针对多癌基因治疗的可行性(SkoskiT，Skorska MN，Campbeii K，et al.J ExpMed，1995，1821645-1653)。尽管在癌症的分子研究包括癌基因和抑癌基因的研究方面取得了巨大的成就，但目前癌症的治疗主要以手术治疗、放疗和化疗为基础，辅以某些生物治疗。传统的化疗药物以转录抑制或DNA损伤为作用机制，缺乏特异性，对人体正常细胞也有严重的毒性作用。核酸化学和生物化学领域的发展及对肿瘤发生的认识进一步加深，使设计出以寡核苷酸为基础的治疗药物成为现实。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，以bcr/abl融合基因和血管内皮细胞生长因子(VEGF)为靶点，采用bcr3/abl2和VEGF基因反义寡核苷酸(AS-ODNs)联合作用于K562细胞系和K562移植瘤，提供CML联合药物治疗和基因治疗的新用途，能增加白血病细胞对化疗药物的敏感性，减少化疗药物的用量，提高其临床疗效。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是设计出具有药用价值的bcr/abl融合基因以及VEGFmRNA反义核酸序列，分别为bcr3/abl2反义寡核苷酸(ASO-B3/A2)互补于bcr3/abl2型融合点两侧各9个核苷酸，序列为5’-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3’。VEGF反义寡核苷酸(ASO-VEGF)互补于VEGF mRNA第3个外显子，序列为5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC-3’。上述两条反义核酸链经全硫代修饰，联合应用于制备治疗慢性粒细胞白血病的药物，可有效抑制白血病细胞生长，增加细胞对凋亡刺激的敏感性，延缓裸鼠移植瘤的生长。所述两种反义核酸的配比浓度分别为50～125nmol/L。所述治疗白血病的药物中，两种反义核酸序列的最佳配比浓度分别为100nmol/L。选择K562细胞做研究对象，通过小鼠体内、体外一系列实验证明上述两条反义核酸序列联合应用对白血病细胞的抑制作用优于任何一条核酸单独应用。本专利技术的有益效果是利用针对不同作用机制的两种反义寡核苷酸联合应用或联合化疗药物治疗癌症，不仅可以提高疗效，同时还可以降低两者单独使用时的副作用。反义核酸联合化疗至少有以下3个优点(1)防止肿瘤耐药细胞耐药性的形成；(2)与化疗药物联合，可增加抗癌疗效，并且能降低药物剂量和毒性；(3)特异性强，特异性地攻击靶细胞，对正常细胞几乎无影响。附图说明图1a为bcr3/abl2和VEGF反义寡核苷酸单独或联合应用对K562细胞的bcr3/abl2和VEGF基因mRNA水平表达的抑制作用。图1b为bcr3/abl2 mRNA表达水平半定量分析。图1c为VEGF mRNA表达水平半定量分析。图2为在无血清条件下，bcr3/abl2和VEGF反义寡核苷酸单独或联合应用对K562细胞增殖的影响。图3为bcr3/abl2和VEGF反义寡核苷酸单独或联合应用对K562细胞对凋亡刺激的敏感性。图4为bcr3/abl2和VEGF反义寡核苷酸单独或联合应用在不同治疗阶段K562细胞裸鼠移植瘤体积的变化。图5各实验组移植瘤组织切片H&E染色和TUNEL原位凋亡检测。其中，A对照组移植瘤的病理形态，光镜HE×100；BASO-B3/A2组移植瘤的病理形态，光镜HE×100；CASO-VEGF组移植瘤的病理形态，光镜HE×100；D联合治疗组移植瘤的病理形态，光镜HE×100。a-d各实验组移植瘤凋亡细胞形态(TUNEL原位凋亡检测)。图6为图5中a-d各实验组移植瘤组织切片免疫组化CD31染色，光镜×200。具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明一、ASO的设计和合成①硫代修饰的bcr3/abl2反义寡核苷酸(ASO-b/a)互补于bcr3/abl2型融合点两侧各9个核苷酸(Skorski T，Szczylick C，Malaguamera L，et al.Folia Histochem Cytobiol，1991，2985～89)，序列为5’-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3’。②全硫代修饰的VEGF反义寡核苷酸(ASO-V)互补于VEGF mRNA第3个外显子(Li XM，Tang ZY，Zhou G，et al.J Exp Clin Cancer Res，1998，171～3)，序列为5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC-3’。③无关反义寡核苷酸(N-ODN)序列为5’-CATTTCTTGCTCTCCACG-3’，经微本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制ｂｃｒ３／ａｂｌ２和ＶＥＧＦ基因功能的反义核酸药物组合物，其特征在于含有序列ＡＳＯ－ｂｃｒ３／ａｂｌ２∶５’－ＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＴ－３’和ＡＳＯ－ＶＥＧＦ：５’－ＧＣＡＧＴＡＧＣＴＧＣＧＣＴＧＡＴＡＧＴＧＣ－３’的反义核酸。

【技术特征摘要】
1.一种抑制bcr3/abl2和VEGF基因功能的反义核酸药物组合物，其特征在于含有序列ASO-bcr3/abl25’-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3’和ASO-VEGF5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC-3’的反义核酸。2.根据权利要求1所述的抑制bcr3/abl2和VEGF基因功能的反义核酸药物组合物，其特征在于所述序列ASO-bcr3/abl25’-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3’和ASO-VEGF5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC-3’经全硫代修饰。3.根据权利要求2所述的抑制bcr3/a...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩忠朝，丛秀丽，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]