一种肿瘤细胞疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤细胞疫苗的制备方法，旨在提供一种不仅能够增加基因载体的转导效率、增加外源基因的表达量，而且能够增加免疫分子Ｈｓｐ－７０、ＭＨＣ－Ⅰ、ＭＨＣ－Ⅱ、ＩＣＡＭ的表达量的肿瘤细胞疫苗制备方法，利用本方法制备的肿瘤细胞疫苗，不仅保证了肿瘤细胞疫苗回输人体的安全性，而且可以增加肿瘤细胞疫苗的抗原性，促进机体产生针对肿瘤细胞的特异性免疫反应，增强肿瘤细胞疫苗的疗效。本发明专利技术通过下述技术方案实现：对细胞进行转基因操作；将细胞在４２～４５℃加热３０～１２０分钟。本发明专利技术的主要用途是：制备自体或异体肿瘤细胞疫苗；体外诱导制备特异性抗肿瘤ＣＴＬ；制备直接参与免疫反应，或作为外源基因分泌细胞的树突细胞、成纤维细胞等其他自体或异体的非肿瘤细胞。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种肿瘤细胞疫苗的制备方法，具体的讲，它涉及一种对细胞进行转基因并结合加热处理来制备肿瘤细胞疫苗的方法。
技术介绍
近年来，肿瘤细胞疫苗的发展为肿瘤的治疗带来了希望。目前用来制备肿瘤细胞疫苗的细胞主要有肿瘤细胞和抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells，APC)两种，所采用的方法通常有以下几种1.直接将死亡的全肿瘤细胞或者肿瘤细胞溶解物作为肿瘤疫苗；2.将进行了基因修饰的APC(一般是DC)作为肿瘤疫苗；3.将抗原提呈细胞尤其是树突状细胞(Dendritic cells，DC)与肿瘤细胞进行融合形成杂交细胞，以杂交细胞的提取物作为肿瘤疫苗(一种肿瘤免疫治疗及预防性疫苗的组成、制备、应用方案，申请号02153446.2)；4.将进行了基因修饰的肿瘤细胞经过处理后制成肿瘤疫苗(Nemunaitis，J.，J.Control Release.2003)。其中，将细胞进行基因修饰的方法一般采用转基因操作，将编码肿瘤细胞缺少的蛋白质的基因、细胞因子基因(如GM-CSF)或者编码“协同刺激分子”(如B7-1)的基因转入肿瘤细胞或DC，从而增强细胞的抗原提呈能力，增加细胞的免疫原性，纠正患者的“免疫耐受状态”，激发和强化患者自身的特异性抗肿瘤免疫功能。目前认为APC功能异常可能是导致肿瘤患者体内缺乏有效的抗肿瘤免疫反应的重要原因，从而造成肿瘤患者的低免疫原性，而不能产生免疫应答。粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)是APC分化、成熟过程中最关键的细胞因子之一，它具有免疫佐剂的作用，能够增强APC的功能，促进APC的增殖和分化，增强APC的吞噬能力而摄取足够的抗原量，增加细胞膜表面MHC分子、辅助刺激分子和粘附分子等的表达，促进细胞分泌细胞因子等。现有报道GM-CSF能显著上调人外周血单个核细胞B7-1和B7-2的表达，并促进APC通过B7分子与T细胞的CD28分子结合，使T细胞释放GM-CSF，而GM-CSF又促进APC表面表达B7分子，在APC和T细胞之间通过GM-CSF形成正反馈调节途径。小鼠黑色素瘤细胞株B16是不表达MHC-II类抗原的，因此不能递呈抗原，无免疫原性，经体内外研究它不能诱导产生针对B16细胞的细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。但在小鼠免疫接种过程中将GM-CSF注射13天，与无佐剂的免疫接种相比，主要和次要的免疫应答反应均得到增强，这说明GM-CSF通过提高APC的功能可以使机体的免疫应答得到增强，调节免疫反应。目前GM-CSF诱导抗肿瘤免疫反应主要用于以下五个方面(1)GM-CSF基因转化的肿瘤细胞用于预防接种；(2)GM-CSF可以增强抗原激发和DC前体细胞的培养；(3)抗原-GM-CSF融合蛋白进行免疫接种；(4)GM-CSF与单抗共同注射用于单抗治疗以增强自发性网络状反应；(5)与抗原接种有关的GM-CSF的应用。经GM-CSF基因修饰的DC能够高表达B7协同刺激分子和其它粘附分子，从而能更有效地提呈抗原，诱导特异性的抗肿瘤CTL反应。有文献报道，接种GM-CSF转基因疫苗可使90％以上的NSCLC患者产生特异性抗瘤免疫反应(Nemunaitis，J.，J.Control Release.2003)。在进行了转基因操作的肿瘤疫苗制备过程中，细胞的处理过程是十分关键的，对于细胞的处理希望达到三个目的1.使细胞不能增殖，保证进入体内的肿瘤细胞不会发展成新的肿瘤灶；2.增加基因表达效率，在基因修饰肿瘤疫苗中，目的基因的表达效率是影响疗效的关键因素；3.促进细胞抗原相关蛋白的表达，如Hsp-70、MHC-I，这些蛋白可以促进细胞肿瘤抗原的呈递，增加肿瘤抗原性。以上这三点对于转基因肿瘤疫苗的安全性和有效性都是十分重要的，这三个方面的改进会进一步增加疗效。传统的细胞处理方式有射线照射(Nemunaitis，J.，J.Control Release.2003)、化疗药物等。但这些方法只能使细胞不再增殖，而对基因载体的转导效率，转入的外源基因的表达量，以及细胞抗原蛋白的表达量基本没有影响。有文献指出，对肿瘤细胞进行加热处理能够增加Hsp-70分子的表达量(Todryk，S.M.，Cancer Immunol.Immunother.2004)。而且，加热处理后的肿瘤细胞在肿瘤转移实验中只能够短暂生长，然后就失去增殖能力(Mise，K.，Cancer Res.1990)。参考文献及专利文献1.Nemunaitis，J. GVAX(GMCSF gene modified tumor vaccine)in advanced stage non small cell lung cancer.J.Control Release.2003 Aug 28；91(1-2)225-31. 2.Todryk，S.M.，Eaton，J.，Birchall，L.，Greenhalgh，R.，Soars，D.，Dalgleish，A.G，Melcher, A.A.，Pandha，H.S. Heated tumour cells of autologous and allogeneic origin elicit anti-tumour immunity. Cancer Immunol.Immunother.2004 Apr；53(4)323-30.Epub 2003 Nov 28. 3.Mise，K.，Kan，N.，Okino，T.，Nakanishi，M.，Satoh，K.，Teramura，Y.，Yamasaki，S.，Ohgaki，K.，Tobe，T. Effect of heat treatment on tumor cells and antitumor effector cells. Cancer Res.1990 Oct 1；50(19)6199-202. 专利一种肿瘤免疫治疗及预防性疫苗的组成、制备、应用方案，申请号02153446.2，申请日2002.11.29。
技术实现思路
本专利技术克服了现有技术中的缺点，提供了一种对细胞进行转基因操作结合加热处理来制备肿瘤细胞疫苗的方法，经过这样的处理后，基因载体的转导效率明显增加，外源基因的表达量增加，更好的实现转基因的效果；同时，有利于细胞抗原暴露的免疫分子Hsp-70、MHC-I、MHC-II、ICAM的表达量也明显增加，从而增强肿瘤疫苗激发的特异性免疫反应，增加肿瘤疫苗的疗效。本专利技术是通过下述技术方案实现的将手术切除的肿瘤组织，通过机械分离或酶消化法或直接通过100目细胞筛，制备成肿瘤细胞单细胞悬液；然后用能够表达粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)的重组腺病毒(Ad-GM-CSF)感染这些原代细胞或培养增殖后的细胞；细胞在42～45℃加热处理30～120分钟，即可得到该种肿瘤的自体肿瘤细胞疫苗。对于难以获得肿瘤组织的情况下，也可以应用有相同肿瘤抗原的肿瘤细胞株来替代手术切除的肿瘤组织，例如前列腺癌细胞株PSA(+)、肺癌细胞株A549、黑色素瘤细胞株A375、肝癌细胞株Hep3B，或者其他异体细胞来进行上述操作，制备异体肿瘤细胞疫苗。所述加热处理的温度最好是42℃，所述加热处理时间最好为60分钟。本专利技术所述的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备肿瘤疫苗的方法，包括以下步骤：ａ）对细胞进行转基因操作；ｂ）将细胞在４２～４５℃加热３０～１２０分钟。

【技术特征摘要】
1.一种制备肿瘤疫苗的方法，包括以下步骤a)对细胞进行转基因操作；b)将细胞在42～45℃加热30～120分钟。2.根据权利要求1所述制备肿瘤细胞疫苗的方法，其特征在于，在制备肿瘤细胞疫苗的过程中，对细胞进行转基因并结合加热处理。3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的细胞是肿瘤细胞、成纤维细胞、树突细胞。4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述细胞的来源可以是原代、传代、自体、异体细胞。5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述热处理的方法可以采用水浴、气浴、金属浴。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小兵，康禹，彭建强，
申请(专利权)人：本元正阳基因技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]