一种诊断方法和用于此的试剂盒技术

本发明专利技术提供用于检测或监测样品中细胞的数目的试剂盒和方法。所述细胞包含含有细胞质（胞质）和细胞外（胞外）结构域的细胞表面结合蛋白（ＣＳＡＰ）。所述试剂盒包括：（ｉ）层析装置；（ｉｉ）ＣＳＡＰ结合试剂。所述方法包括：（ｉ）任选地，将样品与能够裂解或透化具有ＣＳＡＰ的细胞的试剂接触；（ｉｉ）将样品与ＣＳＡＰ结合试剂接触，所述的ＣＳＡＰ结合试剂与ＣＳＡＰ的细胞质结构域结合；和（ｉｉｉ）直接或间接地评估样品中结合的ＣＳＡＰ的水平或存在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术主要涉及诊断领域并且提供用于精确评估来自受试者的样 品中特定细胞类型，其细胞结合蛋白或其可溶(细胞外)形式的存在 或数量的方法和试剂。在一些实施方案中，本专利技术涉及快速的，自足 的诊断，所述诊断可以在大部分环境中使用，例如诊所，实验室，在 野外，在家和在资源贫乏的地区。在一个实施方案中，提供用于评估来自受试者的样品中的CD4 T细胞数目的方法和试剂盒。
技术介绍
主题说明书中的参考文献的著书目录的详细资料还列于说明书结尾。这样的承认或任何形式的暗示，即该现有技术在任何国家中构成公知 常识的部分。不同领域的技术用于研究，分析，开发并且临床上用于检测目的 细胞。手动或自动技术可用于对特别设计的小室中的细胞进行计数， 其允许评估样品中的细胞数目。可以用特殊的染色剂对细胞进行染色 以区别细胞类型。组织化学技术可以用于进一步区分样品中的细胞。 还可以诊断细胞通过增殖或产生细胞因子响应特定抗原，结合其他细 胞，吞噬(engulf )其他细胞或通过趋化作用进行移动的能力。细胞 表面标记对于区分细胞类型和评估样品中特定细胞的数目来说特别有 用。4艮多技术使用抗体以;险测标记的存在。原核和真核生物体的细胞在其所有不同的形式下包含细胞膜，其 将细胞内容物与细胞外环境分隔开。细胞膜是选择性屏障，其决定进 出细胞的物质并且其还与其他细胞和细胞的环境中的分子一起承担复杂的信号传导活动。细胞膜包含磷脂双层并且大多数跨双层膜或与双 层膜相互作用的分子在插入双层膜中的蛋白的帮助下实现跨双层膜或 与双层膜相互作用，所述的蛋白具有细胞质和细胞外部分。通常，细胞与其环境的最初的相互作用经由在质膜上表达的受体 或细胞表面结合分子而产生。不管是通过结合内源性配体(例如细胞 因子或激素)还是外源性配体(例如抗原)，这些受体的活化引发从 细胞膜经细胞质到细胞核的生化级联。已知大量受体或细胞表面结合蛋白质分子介导细胞细胞相互作用和细胞分子相互作用。这些包 括，例如，MHC蛋白，细胞因子，激素或神经递质受体，束缚配体，G 蛋白偶联受体，受体蛋白酪氨酸激酶，受体蛋白酪氨酸磷酸酶，蛋白-丝氨酸/苏氨酸激酶和受体鸟苷酸环化酶。在免疫系统中介导细胞-细胞识别或抗原识别的大多数蛋白包含 Ig或Ig样结构域，暗示它们具有共同的进化历史。这些蛋白包括抗 体，T细胞受体，分化簇(CD)抗原例如CD4， CD8和CD28蛋白，B 和T细胞受体以及与淋巴细胞和其他白细胞上的Fc受体结合的恒定多 肽链。已表征在白细胞表面上的蛋白约一半属于这一超家族。因此， 免疫系统的细胞表达一 系列细胞表面蛋白，所述细胞表面蛋白的同一 性可以用于评估样品中不同细胞的数目和状态。例如，可以用抗B和T细胞抗原受体的恒定区的抗体鉴别B和T 淋巴细胞。可分别基于共受体蛋白CD4和CD8的表达的基础上鉴别T 辅助细胞和细胞毒性T细胞。术检测并计数经过激光束的流中的单独的细胞。通过检查大量细胞， 流式细胞术可以对具有不同分子(例如表征B细胞的表面免疫球蛋白， 称为CD3的T细胞受体相关分子，和区别主要T细胞亚群(subset ) 的CD4和CD8共受体蛋白)的细胞的百分数提供定量数据。用经荧光过特异性抗体接着通过经标记的抗免疫球蛋白抗体对混合群内的单独 的细胞加标签。然后经标记的细胞的悬浮混合物被迫经过孔，产生每流。当各个细胞经过激 光束，细胞散射激光，并且结合到细胞上的任何染料分子将被激发并 且发出荧光。灵敏型光电倍增管检测散射光(提供细胞的大小和粒度 的信息)和荧光发射(提供经标记的抗体的结合信息从而提供各个细 胞的细胞表面蛋白的表达的信息)。如果使用两个或更多抗体，各个 抗体与不同焚光染料偶联，则数据可以以二维散点图的形式或作为等值线图展示，其中对比第二个染料标记的抗体的荧光对第一个染料标 记的抗体的焚光作图，从而用一个抗体标记的细胞群体可以基于其与 第二个抗体的反应性进一步细分。免疫测定是另 一 种特别有用的测定形式，其利用抗体-抗原反应的 特异性，强度和差异来分析样品并且检测其中的特异性组分。大量的免疫测定技术是可获得的，例如在Wild D. "Me /迈/z7w w"a/ ^3/7C^O(^" Nature Publishing Group, 2001中描述的那些4支术。用于检测抗特定抗原的抗体的大量方法也是已知的。例如，在实 验室常规使用酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。 还使用阵列和高通量筛选方法。这些方法通常需要在实验室技术上具 有高水平的技术人员。还开发了多种方法，其不太要求技能并且快速完成，因此，其适 用于在即席检验时(at the point of care)检测抗特定抗原的抗体， 和/或^r测特定抗原。特别地，已经开发侧向流动(lateral flow),测 验片(dipstick)和毛细管试剂盒以测定许多感染，包括病毒感染。患有免疫缺陷性疾病例如AIDS的受试者中，表达CD4的T细胞的 水平是何时开始抗逆转录病毒药物治疗的指标。病毒感染这些T细胞 并且最终破坏它们。低CD4+ T细胞水平还是临床进展风险和机会性感 染的易感性的指标。在一种4企测CD4细胞的方法中，用抗CD4抗体包被的免疫磁珠 (dynabeads)用于结合CD4+T淋巴细胞。用经抗CD14抗体包被的珠 粒将表达CD14和CD4的单核细胞从新鲜血液样品中除去。之后，分离 的CD4 T淋巴细胞被裂解，用吖啶橙进行染色并且经染色的细胞核通爭人，Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2(1): 104-114， 1995中描述。该试剂盒为基 于ELISA的方法，用于测量全血样品中的总CD4。所用的抗体不区别 细胞结合的和可溶的CD4(参见Lyamuya爭乂， J. Imm. Methods.,103-112， 1996)。国际公开号2006/115866描述用于测量CD4 抗原的免疫层析装置。然而，在该文献中仍没有公开能够在来自受试 者的样品中区别细胞结合的CD4和缺失细胞质结构域的可溶的CD4的 捕获试剂。此外，在W0 2006/115866中描述的装置依赖于样品流经一 系列有限的捕获区域以通过渗透试纸条上的连续的捕获区域来捕获 CD4，从而提供样品中的CD4细胞的浓度的可视化指标。需要测量特定细胞类型或它们的细胞结合蛋白的改进的方法，特 别是可以用于即席检验(point of care)和提供快速而精确的结果的 方法。专利技术概述贯穿整个说明书和接着的权利要求书，除非上下文另外要求，词 语"包含"和其变体例如"含有"和"包括"应理解为表示包括所述 的整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其他的整体或步骤或 整体或步骤的组。"由……组成"表示包括并且仅限于短语"由…… 组成"所陈述的任何事物。因此，短语"由……组成"指列出的要素 是必需的或者必要的，并且不可以存在其他要素。"基本由……组成，， 表示包括该短语所陈述的任何要素，并且限于不干扰或不促成公开内 容中指定的列出的要素的活性或作用的其他要素。因此短语"基本 由......组成，，指列出的要素是必需的或必要的，但有没有其他的要素是任选的并且依赖于它们是否影响所列出的要素的活性或作用，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于评估来自受试者的样品中包含细胞质（胞质）和细胞外（胞外）结构域的细胞表面结合蛋白（ＣＳＡＰ）的水平或存在或具有所述ＣＳＡＰ的细胞的水平或存在的方法，该方法包括：　（ｉ）任选地，将样品与能够裂解或透化具有ＣＳＡＰ的细胞的试剂接触 ；　（ｉｉ）将样品与ＣＳＡＰ结合试剂接触，所述的ＣＳＡＰ结合试剂与ＣＳＡＰ的细胞质结构域结合；和　（ｉｉｉ）直接或间接地评估样品中结合的ＣＳＡＰ的水平或存在；和　其中至少包含细胞质结构域的结合的ＣＳＡＰ的水平或存在指示受试 者中具有ＣＳＡＰ的细胞的数目。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：DA安德森，RE劳埃德，SM克罗，ML加西亚，AL蓝黛，
申请(专利权)人：麦克法兰布奈特医疗研究与公共健康研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]