本发明专利技术涉及层析配体，它包含来自葡萄球菌Ａ蛋白（ＳｐＡ）的结构域Ｃ或其功能片段或变体。层析配体呈现耐得住苛刻原位清洁（ＣＩＰ）条件的有利能力，且能结合抗体的Ｆａｂ片段。可以给配体提供末端偶联基团，例如精氨酸或半胱氨酸，以促进它与不溶载体（例如珠或膜）的偶联。本发明专利技术也涉及使用配体分离抗体的方法，和可以包含洗涤步骤和／或用碱再生的纯化规程。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及层析领域，且更具体地涉及适用于抗体分离的新颖的亲 和配体。因而，本专利技术包括这样的亲和配体，包含根据本专利技术的配体的 层析基质，和抗体分离方法，其中使用根据本专利技术的配体。背景术语层析包括一族密切相关的分离方法，它们基于2个互不混溶相 的接触，其中一个相是固定相，且另一个相是流动相。 一个在其中层析 非常重要的领域是生物
，例如用于药物和诊断剂的大规模经济 生产。 一般而言，通过细胞培养细胞内地或通过分泌进周围的培养基中 来生产蛋白。由于使用的细胞系是活生物，所以必须给它们饲喂含有糖、 氨基酸、生长因子等的复合生长培养基。从饲喂给细胞的化合物的混合 物和从其它细胞组分分离所需蛋白至足够的纯度，例如用作人治疗剂， 提出了巨大挑战。在这样的分离中，在第一步中，通常通过过滤来去除细胞和/或细胞 碎片。 一旦已经得到含有目标蛋白的澄清溶液，就经常使用不同层析步 骤(经常基于不同的分离原理)的组合，将目标蛋白与溶液的其它组分 分离。因而，这种步骤基于电荷、疏水性程度、亲和力性质、大小等， 从混合物分离蛋白。几种不同的层析基质，例如用于离子交换、疏水作 用层析(HIC)、反相层析(RPC)、亲和层析和固定化金属亲和层析(IMAC) 的基质，可用于这些技术的每种，从而允许使纯化方案适合包含的特定 蛋白。在医学领域具有不断增加的重要性的 一种示例性的蛋白是免疫球 蛋白，也称作抗体，例如免疫球蛋白G(IgG)。与在所有处理技术中一样，重要的目的是保持低的生产成本。结果， 经常提出改进的层析技术，并可能时重新使用基质。但是，由于层析基 质的每次使用都会留下刚刚进行的操作的某些痕迹，许多不同的清洁规 程都可以用于清洁和/或恢复基质到它的原始形式。需要去除的普遍已知 的材料是例如未洗脱的蛋白和蛋白聚集体以及潜在有害的材料，例如病 毒、内毒素等，它们可以源自细胞培养。最常用的清洁是用緩沖液简单洗涤。为了更有效地清洁基质，经常使用酸和/或碱处理。为了甚至更有效地恢复基质，常用称作原位清洁(CleaninglnPlace)(CIP)的碱性方法。 标准的CIP包含用1MNaOH、 pH14处理基质。这种苛刻处理将有效地 去除上面讨论的类型的不希望的污垢，但是可能另外损害 一些层析基质 材料。例如，其中配体是蛋白或基于蛋白的许多亲和基质不能耐得住标 准的CIP,至少在维持它们的原始性质时不能。已知结构修饰，例如在 碱性条件下天冬酰胺和谷氨酰胺残基肽主链的脱酰胺作用和切割，是在 碱性溶液中处理蛋白后丧失活性的主要原因，且天冬酰胺是这二者中最 敏感的。还已知脱酰胺作用速率是高度特异性的和构象依赖性的，且蛋 白中最短的脱酰胺作用半衰期已经与序列-天冬酰胺-甘氨酸-和-天冬酰 胺-丝氨酸相关联。参见例如Giilich, Linhult, Nygren, Uhlen和Hober (2000) Journal of Biotechnology 80， 169-178。对碱性条件的稳定性可以被 人工改造入蛋白配体。尽管有文件证明的碱敏感性，但A蛋白广泛用作亲和层析基质中的 配体，这是因为它的结合IgG、而不显著影响免疫球蛋白对抗原的亲和力的能力。众所周知，A蛋白是细菌金黄色葡萄球菌(S似/7/7少/0C0CC船ww力的细胞壁的组分。这种葡萄球菌蛋白(称作SpA)由5个结构域 (按照从N末端的次序命名为E、 D、 A、 B和C，它们能在Fc区域结 合抗体)和不结合任何抗体的C-末端区域(或X区域)组成。Jansson 等人(Jansson, Uhlen和Nygren (1998) FEMS Immunology and Medical Microbiology 20, 69-78: All individual domains of staphylococcal protein A show Fab binding)后来表明，所有个别的SpA结构域也在Fab区域 结合某些抗体。US 5,151,350 (Repligen)涉及编码A蛋白和A蛋白-样材料的基因的 克隆和表达。该基因的克隆和它的核普酸序列表征使得1982年首次能 够得到用于在不同的宿主-载体系统中克隆的大量A蛋白-样材料和核苷酸序列。由于实现了 A蛋白在重组系统中的生产，已经提出其它的基因操 作。例如，US 5,260,373 (Repligen)描述了重组蛋白A的基因操作，以促 进其与支持物的附着，且更具体地其通过精氨酸的偶联。此外，US 6，399,750 (Pharmacia Biotech AB)描述了另 一种重组A蛋白配体，其已经 通过半胱氨酸偶联至支持物上。但是，为了维持选择性和结合容量，需要在比常规CIP更温和的条 件下清洁上面讨论的类型的A蛋白层析基质。在该上下文中，应当理解， 清洁与层析基质的寿命密切相关。例如，如果降低的性能是可接受的，那么可以用标准的CIP清洁敏感的基质。因而，已经作出努力来提供呈 现出A蛋白的突出性质(例如选择性)、但是更耐受CIP所用碱性条件 的层析基质。因而，US 6,831,161 (Uhl6n等人)涉及使用固定化的蛋白亲和配体的 亲和分离方法，其中已经修饰一个或多个天冬酰胺(Asn)残基来增加碱稳 定性。该专利也描述了制备稳定化的组合蛋白的方法，其通过修饰蛋白 分子内的Asn残基，以增加蛋白在碱性条件下的稳定性，并随机化蛋白 分子，以修饰它的结合特征实现，和组合蛋白，其中在与随机化步骤分 开的步骤中，已经通过修饰一个或多个它的Asn残基，增加了蛋白在碱 性条件下的稳定性。此外，WO 03/080655 (Amersham Biosciences)涉及免疫球蛋白-结合 蛋白，其中至少一个天冬酰胺残基已经突变成谷氨酰胺或天冬氨酸以外 的氨基酸。根据该专利申请，这种更特异性的突变在最高达约13-14的 pH值赋予比亲本分子增加的化学稳定性。突变的蛋白可以例如源自能 结合免疫球蛋白分子的互补决定区(CDR)以外的区域的蛋白，例如A蛋 白，优选源自葡萄球菌A蛋白的B-结构域。本专利技术也涉及亲和分离基 质，它包含所述突变的免疫球蛋白-结合蛋白作为配体。尽管存在上述向更加碱稳定的基于A蛋白的层析配体的发展，但改 进的配体和层析基质领域中仍然需要抗体的高特异性分离和允许更容 易生产的替代性的野生型配体构建。在US MO6/0134805 (Berg等人)中描述了这样的改进的层析基质的 一个实例，它涉及包含已经固定化了抗体-结合蛋白配体的多孔颗粒的分 离基质。更具体地，已经在配体密度、凝胶相分配系数(Kav)和颗粒大小 方面最优化了公开的层析基质，以提供特别适合于抗体的高容量纯化的 基质。公开的基质的配体可以包含抗体-结合蛋白例如A蛋白、G蛋白 和/或L蛋白。专利技术概述本专利技术的一个方面是，提供新颖的层析配体，它能耐得住重复原位清洁循环。这可以由所附权利要求书定义的、基于来自SpA结构域C 的结构域C的亲和配体来实现。本专利技术的另一个方面是，提供纯化免疫球蛋白的经济方法。这可以 由使用能耐得住重复原位清洁循环的亲和层析配体的方法来实现。从下面的详细公开内容中将明白本专利技术的其它方面和优点。附图简述附图说明图1显示了与其它基于蛋白的配体本文档来自技高网...
【技术保护点】
基本上碱稳定的层析配体，该配体包含一个或多个来自葡萄球菌Ａ蛋白（ＳｐＡ）的结构域Ｃ单位、或其功能片段或变体。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】SE 2006-9-29 0602061-41. 基本上碱稳定的层析配体，该配体包含一个或多个来自葡萄球菌A蛋白(SpA)的结构域C单位、或其功能片段或变体。2. 根据权利要求1的配体，它在0.5MNaOH中温育5小时后，保 留它的原始结合容量的至少95%。3. 根据权利要求1或2的配体，它能结合抗体的Fab部分。4. 根据前迷权利要求中任一项的配体，其中所述结构域C序列对 应于SEQ ID NO 1定义的氨基酸序列。5. 根据权利要求1-4中任一项的配体，其中所述结构域C序列对应 于SEQ IDN0 2定义的氨基酸序列。6. 根据前述权利要求中任一项的配体，它另外包含末端偶联基团， 所述基团优选包含至少 一 个氮和/或硫原子。7. 根据权利要求6的配体，其中所述末端基团包含精氨酸或半胱氨酸。8. 权利要求1-7中任一项定义的多聚体层析配体，它含有至少2个 结构域C单位或至少2个其功能片段或变体。9. 根据权利要求8的配体，其除了所述至少2个结构域C单位或 至少2个其功能片段或变体以外，还包含一个或多个其它基于蛋白的单 位，所述其他基于蛋白的单位优选是碱稳定的。10. 根据权利要求8的配体，它包含2-8个任选通过接头区段偶联 的结构域C单位。11. 编码在权利要求1-10中任一项定义的配体的核酸序列。12. 包含在权利要求11中定义的核酸序列的表达系统。13. 层析基质，其包含偶联到至少一种不溶载体上的权利要求1-10 中任一项定义的配体。14. Fab片段-结合层析基质，其包含偶联到至少一种不溶载体上的 权利要求10中任一项定义的配体。15. 根据权利要求14的基质，其中所述载体包含基本上球形的颗粒o16....
【专利技术属性】
技术研发人员：M哈尔，S拉森，A穆兰伊，G罗德里戈，邹瑾瑜，PM阿伯格，
申请(专利权)人：通用电气健康护理生物科学股份公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]
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