人源化抗人骨桥蛋白抗体制造技术

本发明专利技术提供比以往的抗人骨桥蛋白抗体活性（抗原结合活性、白细胞游走抑制活性等）和／或稳定性（对热、低酸性条件和改性剂的耐性等）优异的人源化抗人骨桥蛋白抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有优异的活性和稳定性的人源化抗人骨桥蛋白抗体、以及使用该抗体的疾病的治疗和诊断方法。
技术介绍
骨桥蛋白(以下称为“OPN”)是在骨中较多含有的酸性钙结合性糖蛋白，已知在人体中，由于mRNA剪切的不同，可以产生骨桥蛋白-a(以下称为“OPN-a”)、骨桥蛋白-b(以下称为“OPN-b”)、骨桥蛋白-c(以下称为“OPN-c”)的至少三种同工型(非专利文献1)。其中，OPN-a的前体具有后述序列表的SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列，通过分泌，信号肽被切割，形成I17-N314成熟体OPN-a。另外，成熟体OPN是通过生物体内的凝血酶，在第168号(为OPN-a时)的精氨酸残基的C末端一侧被切割，形成N末端片段和C末端片段两段。上述OPN在多种生理学和病理学方面担负着重要的功能，例如具有细胞粘附、细胞游走、肿瘤形成、免疫应答和抑制以补体为介质的细胞溶解等功能。该多种功能是以多种细胞表面受体为介质。OPN在内部具有RGD序列(例如OPN-a中的第159～161号残基)，识别该RGD序列的αVβ3、αVβ1和αVβ5等整联蛋白是OPN的主要受体，其中，αVβ3、αVβ1和αVβ5整联蛋白在血管的平滑肌细胞中经由细胞粘附、特别是αVβ3参与巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等的游走。目前的研究也表明：OPN经由SVVYGLR序列(SEQ ID NO.10)与α9β1、α4β1和α4β7整联蛋白结合，但发现了其中α4β1与未被凝血酶切割的OPN(非切割型OPN)和被凝血酶切割的N末端片段(切割-->型OPN)两者结合，而α9β1只与凝血酶切割型OPN结合这样的差异(非专利文献2～4)。该α9和α4、以及β1和β7的整联亚单元相互之间的氨基酸序列间的类似性高。α4β1和α4β7整联蛋白主要在淋巴细胞和单核细胞中发现，而在嗜中性粒细胞中只有极少表达。另一方面，α9β1在嗜中性粒细胞中选择性高表达，经由VCAM-1或腱生蛋白-C(Tenascin-C)等在嗜中性粒细胞游走中担负着必须的功能。另外，α9β1在肌细胞或上皮细胞、肝细胞等中也广泛表达。这样，整联蛋白亚单元α4和α9的细胞质结构域分别经由有微妙不同的细胞内信号转导途径，互相协同地促进白细胞向炎症部位的游走和凝集，增强其浸润活性，由此参与各种炎症反应。这样，各种种类的整联蛋白均促进白细胞的游走，参与炎症反应，因此抑制这些整联蛋白活性的药物被认为潜在性地具有作为抗炎症药物的可能性。例如，整联蛋白αVβ3在破骨细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞等中表达，通过抑制αVβ3整联蛋白与其各种结合配体的结合，例如在关节中期待发挥抑制关节破坏的作用，因此可以实际进行抗αVβ3抗体的开发。但是，属于整联蛋白家族的受体在广泛的组织内普遍表达，在维持生命活动中担负着必须的功能，因此，在类风湿性关节炎或变形性关节炎的治疗中使用整联蛋白的抗体，则在其它部位也有发生同样的抑制的可能性，可能产生副作用。由上述观点考虑，目前为止，已经明确了类风湿性关节炎、变形性关节病等的病因，尝试提供更优异的治疗方法。例如WO02/081522(专利文献1)中发现，风湿病患者和变形性关节病患者，关节腔液的OPN浓度显示高值，并且在风湿病患者中，凝血酶切割型N末端片段占全部OPN的比例增加，确认了OPN与这些疾病的发病有很深相关性。专利文献1中，对于用凝血酶切割OPN得到的N末端片段和C末端片段，制备将各片段分别区别识别的抗体，使用它们进行试验，发现在类风湿性关节炎患者中，特别是由凝血酶-->切割的N末端片段在关节腔内显示高浓度。该N末端片段中均存在人型整联蛋白可识别的RGD序列和SVVYGLR序列(SEQ ID NO.10)，确认同时阻断这两者序列的抗体可广泛抑制OPN与整联蛋白的结合，对于类风湿性关节炎或变形性关节炎等治疗有效。具体来说，专利文献1中制备了抑制人OPN的RGD序列与整联蛋白结合、以及人OPN的SVVYGLR序列(SEQ ID NO.10)与整联蛋白结合的抗体，通过细胞粘附和细胞游走等的试验确认了其效果。并获得了小鼠OPN的该内部序列所对应的合成肽的抗体，使用小鼠的关节炎病态模型，确认了上述抗体作为治疗药的效果。即，小鼠OPN与人OPN在氨基酸序列上、在相同位置上具有可被小鼠的整联蛋白识别的RGD序列和SLAYGLR序列(SEQ IDNO.12)，因此，取得了M5抗体作为同时阻断这些序列的抗体。确认了该M5抗体与小鼠OPN及其凝血酶消化产物的结合被含有RGD序列的GRGDSP肽抑制，该M5抗体抑制由TNF-α活化的、来自小鼠脾脏的单核细胞的游走。在小鼠的颅骨器官培养系统中研究该M5抗体，观察到抑制骨破坏的作用。并且，在小鼠胶原关节炎模型中尝试给予上述抗体，确认显示明显的治疗效果(专利文献1和非专利文献5)。这些结果强烈显示：同时阻断RGD序列与人型整联蛋白的结合、SVVYGLR序列(SEQ ID NO.10)与人型整联蛋白的结合的抗体可抑制OPN与整联蛋白的结合，对于类风湿性关节炎等的治疗有效，并且，不仅对于幼年型类风湿性关节炎或慢性风湿病等风湿病，也期待对于银屑病性关节炎或银屑病的治疗有效。器官移植后的慢性排斥的特征在于：发生血管或支气管的阻塞性病变，从其组织学的研究来看，T细胞和巨噬细胞的活化引发细胞因子和生长因子的生成、血管内皮细胞障碍，并且血管平滑肌增殖引发纤维化等，因此使血管阻塞进展(非专利文献6～8)。已有报道称，这些巨噬细胞的活化或血管平滑肌的纤维化中，-->OPN作为必须的蛋白而发挥功能(非专利文献9)，OPN抑制抗体通过抑制单核细胞或嗜中性粒细胞的游走，可以抑制向上述纤维化发展的过程。因此，期待抑制器官移植后的慢性排斥反应，有助于器官的存活，也期待对于全身性自身免疫疾病、红斑狼疮、葡萄膜炎、白塞氏病、多发性肌炎、系膜增殖性肾小球肾炎、结节病等自身免疫疾病的治疗的效果。还确认了在各种癌症中OPN的表达量增加，OPN促进了癌症的进展和转移(非专利文献10～12)，通过抗OPN抗体癌细胞的增殖和转移得到抑制(专利文献3、非专利文献13)。因此，还期待抗OPN抗体对于各种癌症的治疗发挥作用。WO03/027151(专利文献2)中公开了具有专利文献1所述的小鼠抗人骨桥蛋白抗体2K1可变区和人抗体恒定区的嵌合抗人骨桥蛋白抗体，以及具有2K1抗体的互补决定区和人抗体构架区以及恒定区的人源化抗人骨桥蛋白抗体。时至今日，作为癌症治疗用抗体(例如利妥昔单抗、曲妥单抗、贝伐单抗)、风湿病治疗用抗体(例如英夫利昔单抗、阿达木单抗)、用于抑制移植片排斥的治疗用抗体(例如莫罗单抗、巴利昔单抗)等很多治疗用单克隆抗体已经上市。今后，单克隆抗体制剂由于其特异性和安全性高等的根本性特征，特别是以低分子治疗药的开发较为困难的各种疾病作为目标的研究开发将会得到加速。另一方面，上述抗体药物的开发中，最大的问题是抗体的生产性。目前市售的单克隆抗体的临床给药量大约为数mg/kg水平，因此需要相当大的制备成本。为此，在显示优异的活性的抗体、显示相同活性的抗体中选择表达量高、作为蛋白质的稳定性高的抗体，这在抗体药物应用化中是极重要的因素。专利文献1：国际公开第WO02/0本文档来自技高网...

【技术保护点】
人源化抗人骨桥蛋白抗体，该抗体含有由ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示氨基酸序列组成的重链可变区、和由ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３所示氨基酸序列组成的轻链可变区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2006-5-31 152892/20061.人源化抗人骨桥蛋白抗体，该抗体含有由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.3所示氨基酸序列组成的轻链可变区。2.权利要求1所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体，其中，上述抗体的重链恒定区是人Igγ1。3.权利要求1所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体，其中，上述抗体的轻链恒定区是人Igκ。4.权利要求1所述的人源化抗人骨桥蛋白抗体，其中，上述抗体的重链恒定区为人Igγ1，上述抗体的轻链恒定区为人Igκ。5.人源化抗人骨桥蛋白抗体，该抗体含有由SEQ ID NO.25所示氨基酸序列组成的重链、和由SEQ ID NO.27所示氨基酸序列组成的轻链。6.多核苷酸，该多核苷酸含有编码权利要求1所述人源化抗人骨桥蛋白抗体的重链可变区的序列。...

【专利技术属性】
技术研发人员：山本宣哉，酒井文彦，樋口浩文，鸟饲正治，中岛敏博，
申请(专利权)人：安斯泰来制药有限公司，财团法人化学及血清疗法研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]