本发明专利技术公开了一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品。本发明专利技术提供一种检测样品中微囊藻的标准品，为含有１６Ｓ?ｒＲＮＡ基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述１６Ｓ?ｒＲＮＡ基因的序列是序列表中的序列１。所述重组质粒中的出发质粒是ｐＭＤ－１８Ｔ。本发明专利技术的定量检测微囊藻的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于水环境样品中微囊藻的快速定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品。
技术介绍
由于大量氮、磷等污染物排放到水环境中，水体富营养化已成为全球公共卫生问 题，其直接后果是湖泊、水库等缓流水体形成大面积蓝藻水华。我国一些重要的淡水湖泊如 太湖、巢湖和滇池等每年都有不同程度的蓝藻水华爆发，其优势种主要是微囊藻。蓝藻水华 的大面积爆发，极大地危害水体生态系统的结构和功能，其最主要危害之一就是产生和释 放以微囊藻毒素为主要类型的蓝藻毒素。微囊藻属蓝藻门蓝藻纲色球藻目色球藻科，是我国很多淡水湖泊和水库富营养 化水体中的优势藻类。微囊藻毒素(Microcystins，简称MCs)是由在水体中生长并能形 成水华的几种蓝藻(blue-green algae，亦称为蓝细菌(cyanobacteria))，尤其是微囊藻 (Microcystis)产生的一类藻类毒素。微囊藻毒素是一种肝毒素，长期饮用含有微囊藻毒素 的水，会引发肝损伤甚至肝癌。因此，快速准确地检测水环境中的微囊藻，对于有效预警蓝 藻水华大规模爆发、保障水环境安全具有重要意义。目前，对微囊藻的鉴定方法主要是物理方法和分子生物学方法。1.物理学方法微囊藻鉴定的传统方法是物理方法，其原理是根据不同类的藻都有表明其身分的 特征，如形态学上的差别，色素、色素体、贮藏物质等的差别等等。微囊藻的物理方法分辨主 要是根据形态上的空间布局和群体的构型不同。目前从传统的碘量法发展了很多种方法。(1)离心沉降法取一定量的水样，离心去除上请液，收集藻体，加入少量生理盐 水混勻，用于下一步镜检。该方法快速，可在30min内检测到结果；由于活藻体，色素体等细 胞结构没有破坏，易鉴定，显微图像清晰；所需水样品量少(50 IOOmL)，且不需用化学药 品等(高锡伦，邱俊铎，马宜山.单细胞藻类的两种简易分离法.水产养殖，1992，(2) :9 10.)。(2)显微彩色图像识别法将制备的样本标明藻类的种类和数量后，在高倍显微 镜下，通过CCD摄像将获取的模拟图像信号输入图像采集卡中，并转换成数字图像，将待测 样品的特征信息与计算机中的图像信息进行对比(聂晶晶，李元，杨良.水华微囊藻鉴定技 术研究进展.环境科学导刊.2008，27 (5) :1-5;高建峰，翁天楚，陈琼洁.离心沉降法检测 水中藻类技术.西南给排水，2006，28 (2) :1-4)。该方法自动化程度高，克服了肉眼主观观 察引起的误差。上述方法耗时长、劳动强度大、效率低、需要丰富的经验，非专业人员无法从事；并 且环境对藻类的形态有很大的影响，鉴定出具体的种存在的困难较多，都需要从分子上找 出直接的证据以鉴别。2.分子生物学方法用分子生物学技术对藻类进行鉴定和检测是目前的研究热点之一，这种方法可能重建或证实基于形态学和生理学特征的分类和检测。NUbel等(1999)对底栖蓝细菌和硅 藻的分布进行了研究，发现用16S rRNA基因分析的累积数量是形态学分析的2倍。这说明 了一些形态学相似的类群通过16S rRNA分析可能呈现不同的基因型。研究发现，16S rRNA 能够较好的区别相同属内种间的株系，但对于种以下的株系则显出分辨率不足的缺陷，能 更准确地检测出特定种型的藻。聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)技术在藻的分类和检测中应 用最为广泛，在普通PCR技术的基础上，经历了从相对定量到绝对定量的过渡，发展了定量 PCR(quantitative PCR)技术实时定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)技术是Holland 等在1991年最先提出。该方法实现了 PCR从定性到定量质的飞跃，且具有引物和探针的双 重特异性，且在全封闭的状态下实现扩增及产物分析，结果稳定，可重复性好，同时还有效 减少了污染及对人体的危害，在大批量标本检测中能有效减少劳动量，成为分子生物学和 分子诊断的重要技术平台，广泛应用于环境样品中微生物的检测及研究中。由于定量PCR具有快速、灵敏的优点，因此，可以应用此技术可用于快速检测水环 境中少量的微囊藻，为快速预警提供技术支持。近年一些研究者已经采用real-timePCR技 术检测来水环境中的微囊藻，该技术的关键是对水环境中的微囊藻进行准确定量，其中不 同外标准品的构建成为研究的关键技术。一个单细胞的微囊藻，只含有一个16S基因。有研究表明，在实验室条件下培养的 微囊藻，藻细胞数与16S rRNA基因数一致。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测样品中微囊藻的标准品。本专利技术提供的检测样品中微囊藻的标准品，为含有16S rRNA基因的重组质粒或重 组菌或重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。序列表中的序列1有396个脱氧核糖核苷酸组成。所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。本专利技术的另一个目的是提供检测样品中微囊藻的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤1)以重组质粒或重组菌或重组细胞为标准品模板，用PCR扩增的体系进行实时荧 光定量PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准 曲线；2)用待测样品替换步骤1)中的标准品，进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结 果的临界循环数和标准曲线，得到待测样品中16S rRNA基因的数量，即得到待测样品中微囊藻的数量；所述PCR扩增的体系由实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板组成；所述引 物对中的各引物在体系中的浓度均为0. 1 μ mol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的 序列2，另一条引物为序列表中的序列3。所述标准品模板在所述PCR扩增的体系中的浓度为1. IXlO1拷贝/yL、l. IXlO2 拷贝 / μ L、1. 1 X IO3 拷贝 / μ L、1. 1 X IO4 拷贝 / μ L、1. 1 X IO5 拷贝 / μ L、1. 1 X IO6 拷贝 / μ LU. lX10l#W/yL、l. 1X IO8 拷贝 / μ L 或 1. IX IO9 拷贝 /yL。所述PCR反应中的退火温度为59°C。所述重组质粒或重组菌或重组细胞为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或 重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。本专利技术的第三个目的是提供一种检测微囊藻的试剂盒。本专利技术提供的检测微囊藻的试剂盒，包括引物对，所述引物对中的一条引物为序 列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3。本专利技术的第四个目的是提供一种PCR试剂。本专利技术提供的PCR试剂，包括实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对；所述引物对 中各每个引物在试剂中的浓度均为0. 1 μ mol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的序 列2，另一条引物为序列表中的序列3。16S rRNA基因、引物对、重组质粒或重组细胞在检测样品中微囊藻中的应用也是 本专利技术保护的范围；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1 ；所述引物对中的一条引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3 ；所述重组质粒或重组菌或重组细胞为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或 重组细胞，所述重组质粒中的出发质粒是PMD-18T本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
一种检测样品中微囊藻的标准品，为含有16S rRNA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述16S rRNA基因的序列是序列表中的序列1。2.根据权利要求1所述的标准品，其特征在于所述重组质粒中的出发质粒是 PMD-18T。3.—种检测样品中微囊藻的方法，包括如下步骤1)以重组质粒或重组菌或重组细胞为标准品模板，用PCR扩增的体系进行实时荧光定 量PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；2)用待测样品替换步骤1)中的标准品，进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结果的 临界循环数和标准曲线，得到待测样品中16S rRNA基因的数量，即得到待测样品中微囊藻 的数量；所述PCR扩增的体系由实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板组成；所述引物对 中的各引物在体系中的浓度均为0. 1 μ mol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列 2，另一条引物为序列表中的序列3。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述标准品模板在所述PCR扩增的体系 中的浓度为 1. IXlO1 拷贝 /yL、l. IX IO2 拷贝 /yL、l. IX IO3 拷贝 /yL、l. IX IO4 拷贝 / μ LU. IX IO5 拷贝 / μ L、1. 1 X IO6 拷贝 / μ L、1. 1...
【专利技术属性】
技术研发人员：李丹，何苗，刘丽，施汉昌，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11
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