本发明专利技术公开了一种检测产毒微囊藻的方法及其专用标准品。本发明专利技术提供的一种检测样品中产毒微囊藻的标准品，为含有ｍｃｙＡ基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述ｍｃｙＡ基因的序列是序列表中的序列１。所述重组质粒中的出发质粒是ｐＭＤ－１８Ｔ。本发明专利技术的检测产毒微囊藻的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于水环境样品中产毒微囊藻的快速定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种定量检测产毒微囊藻的方法及其专用标准品。
技术介绍
微囊藻毒素(Microsystems，简称MCs)是蓝藻(cyanobacteria)，尤其是一些微囊 藻(Microcystis)产生的单环七肽，在爆发蓝藻水华的水体中普遍存在。微囊藻毒素是一 种肝毒素，长期饮用含有微囊藻毒素的水，会引发肝损伤甚至肝癌。微囊藻毒素是一类受产毒基因调控，在胞内代谢产生的毒素。研究表明，并非所 有的微囊藻都能够产生微囊藻毒素，微囊藻产毒株(Toxic strains)和无毒株(Nontoxic strains)的毒性是由遗传决定的，两者在形态上没有明显的区别。微囊藻毒素是非核糖体 合成的，由肽合成酶复合体基因簇(mcy)完成。研究发现了 11个与微囊藻毒素合成有关的 基因(mcy A-J),mcy区域的序列分析揭示了双向操纵子的结构(mcy A-C^Pmcy D-J),mcy A-C基因编码多肽合成酶(NRPS)，作用二肽基中间物向七肽基延伸，以及随后肽的环化，mcy D-J基因编码杂合的多酮_多肽合成酶(PKS-NRPS)。已经有研究人员考察了在实验室培养试验中微囊藻毒素在藻细胞和培养基之间 的分配过程，结果表明，处于对数生长期的微囊藻培养物中至多能释放10% -20%的毒素 到培养基中，大多数毒素依然存在于细胞内；当细胞进入静止生长期时，可能随着藻细胞死 亡数量的增加，释放到培养基中的毒素的比例也会有所增加。研究还发现，即使在对数生长 期已经结束，并且藻类培养物的生物量已经非常大的时候，可能只是很少一部分藻细胞会 死亡。因此，藻类生长周期里的大部分时间，溶解态毒素的含量维持在较低水平。在自然水 体中微囊藻毒素大量释放到水柱中一般出现在水华大量衰亡的季节，或者水体中使用了杀 藻剂后都会引起胞内毒素大量的释放。因此，直接检测水体中微囊藻毒素的含量无法满足 蓝藻水华预警和水质安全控制的需要，微囊藻毒素合成酶基因的分离和功能研究不仅揭示 了微囊藻毒素合成的遗传基础，且提供了准确检测产毒微囊藻的方法。定量PCR(quantitative PCR)技术经历了从相对定量到绝对定量的过渡，其中以 实时定量PCR技术应用研究最多。实时定量PCR技术与目前所用的几种方法对比来看，具 有较多优点，例如速度较快，而且不需要用显微镜观察，具有很高的再现性，且此技术全程 闭管操作，没有PCR的后处理过程，污染机率降低。另外，因定量过程的自动化，从而使推广 应用的前景范围更加广阔。一个单细胞的产毒微囊藻，只含有一个拷贝的mcyA基因。有研究表明，在实验室 条件下培养的产毒微囊藻，藻细胞数与mcyA基因数一致。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测样品中产毒微囊藻的标准品。本专利技术提供的标准品，为含有mcyA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述 mcyA基因的序列是序列表中的序列1。3所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。本专利技术的另一个目的是提供一种检测样品中产毒微囊藻的方法。本专利技术提供的检测样品中产毒微囊藻的方法，包括如下步骤1)以重组质粒或重组菌或重组细胞为标准品模板，用PCR扩增的体系进行实时荧 光定量PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准 曲线；2)用待测样品替换步骤1)中的标准品，进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结 果的临界循环数和标准曲线，得到待测样品中mcyA基因的数量，即得到待测样品中产毒微 囊藻的数量；所述PCR扩增的体系由实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板组成；所述引 物对中的各引物在体系中的浓度均为0. 1 μ mol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的 序列2，另一条引物为序列表中的序列3。所述标准品模板在所述PCR扩增的体系中的浓度为1. 12X102拷贝/yL、 1. 12 X IO3 拷贝 / μ L、1. 12 X IO4 拷贝 / μ L、1. 12 X IO5 拷贝 / μ L、1. 12 X IO6 拷贝 / μ L、 1. 12Χ IO7 拷贝 / μ L 或 1. 12Χ108 拷贝 /yL。所述PCR反应中的退火温度为59°C。所述重组质粒或重组菌或重组细胞为含有mcyA基因的重组质粒或重组菌或重组 细胞；所述mcyA基因的序列是序列表中的序列1。序列表中的序列1由376个脱氧核糖核苷酸组成。所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。所述样品具体为水样。本专利技术第三个目的是提供一种检测产毒微囊藻的试剂盒。本专利技术提供的检测产毒微囊藻的试剂盒，包括引物对，所述引物对中的一条引物 为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3。本专利技术第四个目的是提供一种PCR试剂。本专利技术提供的PCR试剂，包括实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对；所述引物对 中各每个引物在试剂中的浓度均为0. 1 μ mol/L.所述引物对中的一条引物为序列表中的 序列2，另一条引物为序列表中的序列3。mcyA基因、引物对、重组质粒或重组细胞在检测样品中产毒微囊藻中的应用也 是本专利技术保护的范围；所述mcyA基因的序列是序列表中的序列1 ；所述引物对中的一条 引物为序列表中的序列2，另一条引物为序列表中的序列3 ；所述重组质粒或重组菌或重 组细胞为含有mcyA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞，所述重组质粒中的出发质粒是 PMD-18T。本专利技术的实验证明，本专利技术的定量检测微囊藻的标准品具有广谱识别和特异性相 结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于 水环境样品中产毒微囊藻的快速定量检测。本专利技术在产毒微囊藻基因mcyA上设计特异性 引物，采用real-time PCR定量检测水环境中产毒微囊藻，其关键的技术是制备外标准品， 优化real-time PCR反应条件。由于定量PCR具有快速、灵敏的优点，因此，该技术可用于 快速检测水环境中少量的产毒微囊藻，为蓝藻水华快速预警提供技术支持。附图说明图1利用引物(序列2和序列3)检测绿藻小球藻(无毒株)和铜绿微囊藻(产 毒株)图2定量PCR扩增曲线图3定量PCR标准曲线图4定量PCR熔解曲线5标准品定量PCR凝胶电泳6为利用显微镜计数法和定量PCR方法检测产毒铜绿微囊藻基因(mcyA)浓度 比较图7实际水样定量PCR检测的熔解曲线具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、定量检测微囊藻的标准品pMD-18T-mcyA质粒标准品制备1.铜绿微囊藻的培养产毒株铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)编号为FACHB-905，为购自中国科 学院武汉水生生物研究所。根据中国科学院水生生物研究所提供的培养方法，培养铜绿微 囊藻。根据提供的配方(表1)配置BGll培养基，即在IOOOmL去离子水中，分别加入以下 物质，灭菌后4 °C保存。表IBGll培养基配方本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
一种检测样品中产毒微囊藻的标准品，为含有mcyA基因的重组质粒或重组菌或重组细胞；所述mcyA基因的序列是序列表中的序列1。2.根据权利要求1所述的标准品，其特征在于所述重组质粒中的出发质粒是 PMD-18T。3.—种检测样品中产毒微囊藻的方法，包括如下步骤1)以重组质粒或重组菌或重组细胞为标准品模板，用PCR扩增的体系进行实时荧光定 量PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；2)用待测样品替换步骤1)中的标准品，进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结果的 临界循环数和标准曲线，得到待测样品中mcyA基因的数量，即得到待测样品中产毒微囊藻 的数量；所述PCR扩增的体系由实时荧光定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板组成；所述引物对 中的各引物在体系中的浓度均为0. 1 μ mol/L，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列 2，另一条引物为序列表中的序列3。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述标准品模板在所述PCR扩增的体系 中的浓度为 1. 12父102拷贝/1^、1. 12 X IO3 拷贝 /yLU. 12 X IO4 拷贝 /yLU. 12 X IO5 拷 贝 /μ L,l. 12Χ106 拷贝 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：李丹，何苗，刘丽，施汉昌，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11
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