一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器及其制备方法。所述生物电极传感器是在丝网印刷电极的工作电极上修饰多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜，并在多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜的表面进一步交联上MC-LR型微囊藻毒素抗体。本发明专利技术传感器分析速度快，样品用量少，易于发展手持设备，便于实现定点和实时测试，而且成本远低于大型的分析检测仪器，因此可以进行推广普及满足家庭测量需求。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器及其制备方法和应用
本专利技术属于电化学分析和纳米材料
，特别涉及一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
微囊藻毒素(Microcystin，简称MC)是蓝藻产生的多肽毒素，为环状结构，有多种变型，含量较多、毒性较大的主要是MC-LR、MC-RR、MC-YR这三种微囊藻毒素(L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)，本专利技术主要针对MC-LR型微囊藻毒素进行检测。微囊藻毒素会使水体中其他生物中毒，而且也会对人类的健康产生很多潜在的危害。人们在皮肤接触含有微囊藻毒素的水体时会引起如眼睛等敏感部位过敏，少量喝入可引起急性肠胃炎，而且微囊藻毒素是一种肝毒素，是肝癌的强烈促癌剂，长期饮用则可能引发肝癌，因此对微囊藻毒素的研究已经成为水体环境科学研究的重要内容，快速、准确的检测微囊藻毒素具有重要的现实应用意义，能够实现对水体的检测预警，及时采取预防措施。目前微囊藻毒素的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)等。现有常用的检测方法都表现出了一些局限性，如HPLC法毒素需要进行预处理，灵敏度较低，检测设备比较昂贵而且需要专业人员操作；ELISA法操作步骤繁琐、成本较高等。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器；本专利技术的第二个目的是提供一种制备该生物电极传感器的方法；本专利技术的第三个目的是提供一种利用该生物电极传感器检测MC-LR型微囊藻毒素的方法。本专利技术采用如下技术方案：一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器，所述生物电极传感器是在丝网印刷电极的工作电极上修饰多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜，并在多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜的表面进一步交联上MC-LR型微囊藻毒素抗体。在上述方案的基础上，所述丝网印刷电极是标准三电极，PET基底，工作电极是碳(直径3mm)，对电极是碳，参比电极是银/氯化银。一种制备如上所述的用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器的方法，具体制备步骤如下：(1)将壳聚糖(CS)溶于0.5％的稀盐酸溶液中，室温条件下磁力搅拌40min，再进行抽滤得到1.0wt％的壳聚糖溶液；(2)将多壁碳纳米管(MWCNTs)加入到步骤(1)中所得的壳聚糖溶液中，室温条件下磁力搅拌3h，初步得到多壁碳纳米管分散的壳聚糖溶液，其中多壁碳纳米管的浓度为0.5mg/mL；(3)将步骤(2)中所得的多壁碳纳米管分散的壳聚糖溶液超声10min，进一步得到均匀分散的多壁碳纳米管-壳聚糖溶液，用1.0wt％的氢氧化钠溶液调节此混合溶液的pH值为4.0～6.0；(4)将丝网印刷电极(SP)浸入到步骤(3)中所得的多壁碳纳米管-壳聚糖混合溶液中，进行电沉积，电沉积电压为-1.5～-3.0V，沉积时间为20～300s，形成多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜，再用超纯水洗涤得到初步修饰电极(CS-MWCNTs/SP)；(5)将步骤(4)中制得的CS-MWCNTs/SP电极浸入到1.0wt％的戊二醛溶液中0.5～1h；(6)将步骤(5)中所得修饰后的CS-MWCNTs/SP电极用超纯水洗涤，在其工作电极上滴加5～25μLMC-LR型微囊藻毒素抗体溶液(anti-MC-LR)，室温条件下静置交联0.5～3h，得到目标检测(anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)电极；一种检测MC-LR型微囊藻毒素的方法，具体步骤如下：(1)制备标准HRP酶标微囊藻毒素溶液：将不同浓度的微囊藻毒素溶液(MC-LR)分别与微囊藻毒素HRP酶标物溶液(HRP-MC-LR)以等体积混合，得到一系列标准HRP酶标微囊藻毒素混合溶液(MC-LR+HRP-MC-LR)，其混合液中MC-LR的浓度是0.0、0.3、0.8、1.0、2.0ppb；(2)将生物电极传感器anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP用超纯水洗涤，在其工作电极上分别滴加5～25μL步骤(1)中所制备的MC-LR+HRP-MC-LR溶液，在室温条件下孵育0.5～3h，得到具有不同浓度MC-LR的修饰电极：MC-LR+HRP-MC-LR/anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP；(3)分别测试步骤(2)中孵育后的MC-LR+HRP-MC-LR/anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP电极的电流值Ip；(4)绘制MC-LR浓度与Ip的标准曲线；(5)将待测的微囊藻毒素溶液(MC-LR)与微囊藻毒素HRP酶标物溶液(HRP-MC-LR)以等体积混合，取5～25μL混合液滴加到超纯水洗涤过的生物电极传感器上(anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)，室温条件下孵育0.5～3h，测试孵育后电极的电流值Ip；结合步骤(4)绘制的标准曲线即可得到待测样品溶液中微囊藻毒素的浓度。在上述方案的基础上，步骤(3)中测试电流值Ip的方法为：测试工作液为含有2mM对苯二酚(HQ)、1mM双氧水(H2O2)的0.05MPBS(pH＝7.0)缓冲液，电化学检测方法为微分脉冲伏安法。本专利技术的有益效果是:本专利技术通过生物电极传感器实现微囊藻毒素的检测，生物电极传感器将生物样品固定在修饰过的电极表面，将生物分子间的相互作用转化为电信号从而达到检测生物反应活动的目的，电信号输出比ELISA法的光信号更加稳定、灵敏。生物电极传感器可由选择性好的生物材料如特异性抗体构成目标分子的识别元件，可以实现与特定的底物分子发生反应，更具有专一性。生物电极传感器相应的检测系统比较简单，分析速度快，样品用量少，易于发展手持设备，便于实现定点和实时测试，而且成本远低于大型的分析检测仪器，因此可以进行推广普及满足家庭测量需求。本专利技术采用活性的海洋多糖壳聚糖为生物电极传感器的载体，壳聚糖是来自于海洋的生物活性多糖，具有好的成膜特性、生物相容性，可以作为电极传感器的修饰材料，用于进一步固定生物活性物质如抗体，显著提高电极负载抗体后的稳定性。本专利技术引入了多壁碳纳米管，其具有大的比表面积、良好的导电性，可以促进电极检测过程中电子的传递，进一步增强壳聚糖膜的导电性，从而提高响应速度，具有更高的检测灵敏度。本专利技术通过实验可以得到壳聚糖、多壁碳纳米管的混合溶液，通过电沉积的方法实现丝网印刷电极的修饰，即采用电信号进行电极修饰，不同于一般的滴涂法，相应的电沉积电压、电沉积时间更容易控制，得到的修饰电极重现性更好，为进一步固定微囊藻毒素抗体奠定良好基础。另外此生物电极传感器的检测过程将生物分子间的相互作用转化为电信号进行检测，即以电信号形式输出，不同于传统的检测微囊藻毒素的光信号输出，电信号灵敏度更高，信号更稳定，且易于操作，进而实现快速准确的检测微囊藻毒素的目的。附图说明图1一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器(a)未加入HRP酶标物溶液孵育的电极和(b)加入HRP酶标物溶液孵育的电极的微分脉冲伏安曲线图。图2一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器检测微囊藻毒素的标准曲线图(内插图是此生物电极传感器检测微囊藻毒素的微分脉冲伏安曲线图)。具体实施方式下面通过具体实施例，结合附图对本专利技术作进一步说明。本实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测MC‑LR型微囊藻毒素的生物电极传感器，其特征在于，所述生物电极传感器是在丝网印刷电极的工作电极修饰上多壁碳纳米管‑壳聚糖电沉积薄膜，并在多壁碳纳米管‑壳聚糖电沉积薄膜的表面进一步交联上MC‑LR型微囊藻毒素抗体。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测MC-LR型微囊藻毒素的生物电极传感器，其特征在于，所述生物电极传感器是在丝网印刷电极的工作电极修饰上多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜，并在多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜的表面进一步交联上MC-LR型微囊藻毒素抗体；所述丝网印刷电极是标准三电极，PET基底，工作电极是碳，直径3mm，对电极是碳，参比电极是银/氯化银；制备方法具体制备步骤如下：(1)将壳聚糖溶于0.5％的稀盐酸溶液中，室温条件下磁力搅拌40min，再进行抽滤得到1.0wt％的壳聚糖溶液；(2)将多壁碳纳米管加入到步骤(1)中所得的壳聚糖溶液中，室温条件下磁力搅拌3h，初步得到多壁碳纳米管分散的壳聚糖溶液，其中多壁碳纳米管的浓度为0.5mg/mL；(3)将步骤(2)中所得的多壁碳纳米管分散的壳聚糖溶液超声10min，进一步得到均匀分散的多壁碳纳米管-壳聚糖溶液，用1.0wt％的氢氧化钠溶液调节此混合溶液的pH值为4.0～6.0；(4)将丝网印刷电极浸入到步骤(3)中所得的多壁碳纳米管-壳聚糖溶液中，进行电沉积，电沉积电压为-1.5～-3.0V，沉积时间为20～300s，形成多壁碳纳米管-壳聚糖电沉积薄膜，再用超纯水洗涤得到初步修饰电极CS-MWCNTs/SP；(5)将步骤(4)中制得的CS-MWCNTs/SP电极浸入到1.0wt％的戊二醛溶液中0.5～1h；(6)将步骤(5)中所得修饰后的CS-MWCNTs/SP电极用超纯水洗涤，在其工作电极上滴加5～25μLMC-LR型微囊藻毒素抗体溶液，室温条件下静置交联0.5～3h，即得到目标检测电极传感器anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP。2.一种检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：施晓文，苏晓明，曹发，刘桂亭，
申请(专利权)人：青岛海佑海洋生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37