本发明专利技术公开了一种携带荧光素酶报告基因的ＨＳＶ－１ＢＡＣ系统的构建方法，步骤是：Ａ、构建系统：（１）根据ＨＳＶ－１Ｆ株序列设计引物；（２）构建转移载体；（３）构建重组病毒；（４）噬斑纯化；（５）重组病毒的鉴定：（６）构建重组ＢＡＣ；（７）重组病毒的拯救；（８）生长曲线测定；Ｂ、构建Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ稳定表达系统：（１）设计扩增Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－Ｈｙｇｒ引物；（２）用高保真ＫＯＤ酶扩增片段；（３）将ｐＨＳＶ－１ＢＡＣ电转化到Ｅ．ｃｏｌｉＤＹ３８０中；（４）取回收的ＤＮＡ片段电转化到ｐＨＳＶ－１ＢＡＣ／ＤＹ３８０电转化感受态细胞中；（５）鉴定；（６）挑取ＤＹ３８０单克隆；（７）ＢＡＣ质粒提取；（８）病毒拯救；（９）将ＨＳＶ－１ＢＡＣＬｕｃ重组病毒感染细胞，在体外对病毒进行半定量。方法易行，操作简便，既可在体外对病毒基因组进行修饰，又可在体外对病毒粒子进行半定量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学与病毒学领域。更具体涉及一种新型的携带荧光素酶 报告基因的HSV-I BAC系统的构建方法。这种新型的HSV-I反向遗传操作系统可以用于在 大肠杆菌内对病毒基因组进行快速、准确的改造，同时又可以方便快捷地在体外对病毒进 行半定量，为进一步开展病毒功能基因组结构和蛋白质组学的研究、建立HSV-I基因治疗 和高效疫苗病毒载体系统奠定了坚实的基础。
技术介绍
疱疹病毒是一大类具有囊膜的双链线性DNA病毒，基因组大小约125 245 kb，能 感染人类及多种动物。疱疹病毒科包括110多种病毒，根据其生物学特性及临床致病特点 的不同可分为α、β、Y三个亚科。I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus I ,HSV-1) 属于α亚科，具有较强的感染性。它有着独特的生活周期，感染后可在生物体内长期潜伏， 终生存在，并能在一定的刺激条件作用下，由潜伏感染转入裂解性感染，导致疾病的反复发 作，给患者生活及临床治疗带来了极大困难。治疗用药因耐药性问题日益显著，因而急需寻 找开发新型的抗病毒药物和疫苗。而这个过程中对病毒分子生物学特性的研究是关键。由于疱疹病毒基因组庞大(125 245 kb)，过去往往对单个基因进行表达分析， 虽然为基因在体内的功能研究提供了线索，但更深的了解仍然需要在病毒基因组中进行遗 传分析。了解其复制和致病性分子特征的重要途径是，通过对感兴趣的基因进行定向突变 产生有感染性的子代病毒，进一步研究这种突变对病毒表型的影响一即病毒学研究中的 “反向遗传技术(reverse genetics) ”。疱疹病毒的反向遗传技术在早期是应用常规的分子 克隆技术，经过了需要辅助病毒参与、在真核细胞中重组并重建病毒的阶段，或使用重叠粘 粒库转染细胞、重组构成疱疹病毒全基因组并产生子代病毒。其中，载体构建和重组病毒的 筛选等工作费时又费力。随着大DNA片段克隆载体如酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染 色体(bacterial artificial chromosome, BAC)及相关操作技术的出现，疱疹病毒的遗传 分析也发展到一个新的阶段，即在BAC基础上的全长基因组感染性克隆技术。该技术允许 病毒基因组以BAC形式在大肠杆菌(五coli)中保存、增殖和引入人工突变，BAC质粒转染 到真核细胞即可重建病毒，经过复制的病毒可用于进一步的表型分析。这种在原核_真核 细胞之间往返的操作系统构成一个穿梭系统，从理论上讲，它允许对病毒基因组中任何基 因的任何遗传修饰。BAC技术在α、β、Y疱疹病毒亚科成员的基因组感染性克隆中都已获得成功， 主要是应用于探索病毒的基因功能，可以用于研究病毒的复制、生长特性、致病性、病毒与 宿主之间的关系如侵袭与免疫、潜伏感染、细胞嗜性、调节细胞信号功能等。通过构建重组 病毒突变体将基因置于病毒基因组的背景中进行研究，是解析疱疹病毒功能基因组学、蛋 白质组学和研究病毒感染和致病机理最有效的方法。传统的同源重组方法获得病毒突变 株难度大、无法对必需基因进行缺失或者突变操作，因此将HSV-I全基因组克隆入细菌人 工染色体，可以在大肠杆菌中开展病毒基因组的改造，提高构建重组病毒的效率，这将为4HSV-I的基础和应用研究建立良好的技术平台。先前的研究已有一些HSV-I的BAC感染性 克隆被报道，但有些由于BAC骨架的插入导致某些病毒基因被失活，有些又由于缺少合适 的筛选标记使得后续的重组病毒的分离纯化变得困难。因而建立新型的、操作更为方便的 重组BAC系统对于HSV-I的分子生物学功能研究具有非常重要的理论和实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种携带荧光素酶报告基因的HSV-I BAC系统的构建 方法，方法易行，操作简便，该方法在系统中引入了绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶 (Luciferase)双报告基因，既能在体外方便地对病毒基因组进行修饰，又能方便地在体外 对病毒粒子进行半定量，从而极大地简化了疱疹病毒的反向遗传学研究。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术方案一种新型的携带荧光素酶报告基因的HSV-I BAC系统的构建方法，它包含了 GFP和 Luciferase的双重报告基因，其构建可分为两个过程首先将病毒基因组插入BAC载体构 建重组BAC，然后将Luciferase导入重组BAC构建新型的含Luciferase的重组BAC。其步 骤是1、构建HSV-I BAC系统: 其具体方案包括下列步骤(1)根据HSV-I F 株序列(Accession no. GU734771)设计含 HSV-1 UL37 和 UL38 同源 臂和BAC载体序列的引物(小写字母显示的是酶切位点，斜体显示的是保护性碱基)，引物 由上海生工生物技术有限公司合成，其序列为UL37 forward :7^ggatccGAGCTGCAGCAGGCTGGAGUL37 reverse :07( aagcttATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGTGGCCG TATAACACCCUL38 forward =^aagcttATAACTTCGTATAATGTATGCTAT ACGAAGTTATAAGTCCCGG CATCCCGTTCGUL38 reverse ^rggatccGCCCAAACAGCCGCTCCAG(2)构建转移载体pUSF6:1)用高保真酶KOD (日本Toyobo公司)以及上述引物使用PCR扩增UL37和UL38臂， 分别用回收试剂盒(北京Tiangen公司)回收；UL37臂PCR产物经I酶切后试剂盒回 收，pBluescript SK+ (pBSSK)载体(美国 Stratagene 公司)用 I 禾Π ^boR V双酶切 后试剂盒回收，上述片段经连接转化构建重组质粒PBSSK-UL37，然后用fee I酶切后用T4 DNA聚合酶(美国NEB公司)补平，然后用I酶切，回收后的片段与同样用I酶切 后回收的UL38臂片段连接，构建pBSSK-UL37-UL38质粒；2) BAC ic#pUSF5 (Zhang, Ζ. , Rowe, J. , Wang, W. , Sommer, Μ. , Arvin, Α., Moffat, J. & Zhu, H. (2007). Genetic analysis of varicella-zoster virus ORFO to0RF4 by use of a novel luciferase bacterial artificial chromosome system. J Virol81，9024-9033.)用HinA III酶切后用碱性磷酸酶(CIP)(美国NEB公司)进行去5磷酸化；PBSSK-UL37-UL38质粒经历/ d III酶切后，通过1. 5% (质量体积比，下相同)的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，试剂盒回收UL37-UL38片段，与经CIP处理过的 PUSF5载体进行连接，构建转移载体PUSF6。 (3)构建HSV-I BAC重组病毒1)将pUSF6用BarMI线性化，试剂盒回收；2)取2mg pUSF6用Lipofectamine 2000本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种携带荧光素酶报告基因的ＨＳＶ－１ ＢＡＣ系统的构建方法，其步骤是：Ａ、构建ＨＳＶ－１ ＢＡＣ系统：（１） 根据ＨＳＶ－１ Ｆ株序列设计含ＨＳＶ－１ ＵＬ３７和ＵＬ３８同源臂和ＢＡＣ载体序列的引物，其序列为：ＵＬ３７ ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＡｇｇａｔｃｃＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧ；ＵＬ３７ ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＣＧａａｇｃｔｔＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＡＧＴＧＧＣＣＧＴＡＴＡＡＣＡＣＣＣ；ＵＬ３８ ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＧＣａａｇｃｔｔＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴ ＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＡＧＴＣＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＧＴＴＣＧ；ＵＬ３８ ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＴｇｇａｔｃｃＧＣＣＣＡＡＡＣＡＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧ；（２） 构建转移载体ｐＵＳＦ６： ａ）用高保真酶ＫＯＤ以及上述引物使用ＰＣＲ扩增ＵＬ３７和ＵＬ３８臂，分别用回收试剂盒回收；ＵＬ３７臂 ＰＣＲ产物经ＢａｍＨⅠ酶切后试剂盒回收，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（ｐＢＳＳＫ）载体用ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅤ双酶切后试剂盒回收，上述片段经连接转化构建重组质粒ｐＢＳＳＫ－ＵＬ３７，然后用ＳａｃⅠ酶切后用Ｔ４ ＤＮＡ聚合酶补平，然后用ＢａｍＨⅠ酶切，回收后的片段与同样用ＢａｍＨⅠ酶切后回收的ＵＬ３８臂片段连接，构建ｐＢＳＳＫ－ＵＬ３７－ＵＬ３８质粒；ｂ）ＢＡＣ载体ｐＵＳＦ５用ＨｉｎｄⅢ酶切后用碱性磷酸酶进行去磷酸化；ｐＢＳＳＫ－ＵＬ３７－ＵＬ３８质粒经ＨｉｎｄⅢ酶切后，通过１．５％质量体积比的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，试剂盒回收ＵＬ３７－ＵＬ３８片段，与经ＣＩＰ处理过的ｐＵＳＦ５载体进行连接，构建转移载体ｐＵＳＦ６；（３）构建ＨＳＶ－１ ＢＡＣ重组病毒：ａ）将ｐＵＳＦ６用ＢａｍＨⅠ线性化，试剂盒回收；ｂ） 取２ ｍｇ ｐＵＳＦ６用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００转染非洲绿猴肾细胞，然后用野生型Ｆ株ＨＳＶ－１（ｗｔ ＨＳＶ－１ Ｆ）进行感染，选择表达绿色荧光的噬斑即为重组型； （４） 重组病毒的噬斑纯化：将绿色荧光的噬斑进行１０、１００、１０００倍稀释后分别感染新鲜的单层Ｖｅｒｏ细胞，挑取只表达绿色荧光的噬斑，重复此过程２～３次直到最终病毒感染的细胞全部表达绿色荧光，为ＨＳＶ－１ＢＡＣ； （５）重组病毒的鉴定：以纯化的ＨＳＶ－１ ＢＡＣ重组病毒感染Ｖｅｒｏ细胞，提取病毒基因组，然后用ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲⅠ...
【技术特征摘要】
一种携带荧光素酶报告基因的HSV 1 BAC系统的构建方法，其步骤是A、构建HSV 1 BAC系统(1) 根据HSV 1 F株序列设计含HSV 1 UL37和UL38同源臂和BAC载体序列的引物，其序列为UL37 forwardTAggatccGAGCTGCAGCAGGCTGGAG；UL37 reverseCCGaagcttATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGTGGCCGTATAACACCC；UL38 forwardCGCaagcttATAACTTCGTATAATGTATGCTAT ACGAAGTTATAAGTCCCGGCATCCCGTTCG；UL38 reverseATggatccGCCCAAACAGCCGCTCCAG；(2) 构建转移载体pUSF6 a) 用高保真酶KOD以及上述引物使用PCR扩增UL37和UL38臂，分别用回收试剂盒回收；UL37臂 PCR产物经BamHⅠ酶切后试剂盒回收，pBluescript SK+(pBSSK)载体用BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切后试剂盒回收，上述片段经连接转化构建重组质粒pBSSK UL37，然后用SacⅠ酶切后用T4 DNA聚合酶补平，然后用BamHⅠ酶切，回收后的片段与同样用BamHⅠ酶切后回收的UL38臂片段连接，构建pBSSK UL37 UL38质粒；b)BAC载体pUSF5用HindⅢ酶切后用碱性磷酸酶进行去磷酸化；pBSSK UL37 UL38质粒经HindⅢ酶切后，通过1.5%质量体积比的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，试剂盒回收UL37 UL38片段，与经CIP处理过的pUSF5载体进行连接，构建转移载体pUSF6； (3)构建HSV 1 BAC重组病毒a)将pUSF6用BamHⅠ线性化，试剂盒回收；b) 取2 mg pUSF6用Lipofectamine 2000转染非洲绿猴肾细胞，然后用野生型F株HSV 1(wt HSV 1 F)进行感染，选择表达绿色荧光的噬斑即为重组型； (4) 重组病毒的噬斑纯化将绿色荧光的噬斑进行10、100、1000倍稀释后分别感染新鲜的单层Vero细胞，挑取只表达绿色荧光的噬斑，重复此过程2~3次直到最终病毒感染的细胞全部表达绿色荧光，为HSV 1 BAC； (5)重组病毒的鉴定以纯化的HSV 1 BAC重组病毒感染Vero细胞，提取病毒基因组，然后用HindⅢ和EcoRⅠ进行酶切鉴定；(6)构建穿梭型的重组BAC a) 扩增HSV 1 BAC重组病毒，测定病毒滴度，以10 m. o. i.的HSV 1 BAC病毒感染Vero单层细胞2~3 h后，刮取细胞，提取环状病毒基因组；b) 环状病毒基因组经透析后，电转化到大肠杆菌DH10B电转化感受态细胞中，均匀涂在12.5 mg/ml有氯霉素抗性的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜；c) 挑取单个克隆，37 ℃培养过夜，碱裂解法小量提取BAC质粒，经HindⅢ酶切分析，选择与预期条带相符的克隆作为候选克隆，为pHSV 1 BAC；(7) vHSV 1 BAC重组病毒的拯救a)按照NucleoBond的BAC质粒提取试剂盒说明书，500 ml过夜培养的菌液用于提取pHSV 1 BAC质粒，最后用200 mL...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑春福，李友，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：83[]
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