【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】GRG31和GRG36EPSP合酶的定向进化专利
本专利技术涉及植物分子生物学，特别是赋予提高的除草剂草甘膦抗性或耐受性的新 EPSP合酶多肽。专利技术背景N-膦酰基甲基甘氨酸通常称为草甘膦，是一种重要的农事化学品。草甘膦抑制将 磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)转化成5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸的酶。 对该酶(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶；本文称为“EPSP合酶”或“EPSPS”)的抑制通 过关闭莽草酸路径、由此抑制芳族氨基酸生物合成而杀死植物细胞。由于草甘膦类除草剂抑制芳族氨基酸生物合成，故它们不仅杀死植物细胞，而且 还对细菌细胞有毒。草甘膦抑制许多细菌EPSP合酶，因而对这些细菌有毒。不过，某些细 菌EPSP合酶对草甘膦具有高耐受性。植物细胞对草甘膦毒性的抗性可以通过转化植物细胞使之表达抗草甘膦的细 菌EPSP合酶而产生。特别地，来自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)CP4株的该 细菌基因已经用来继在植物中表达后赋予植物细胞除草剂抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) CT7株的突变EPSP合酶赋予细菌细胞草甘膦抗性，并赋予植物 细胞草甘膦抗性(美国专利No. 4，535，060 ；4, 769，061 ；和5，094，945)。美国专利6，040, 497报道了突变玉米EPSP合酶，具有102位苏氨酸至异亮氨酸 取代、以及106位脯氨酸至丝氨酸取代(“TIPS”突变)。这些改变赋予所述玉米酶草甘膦 抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌CT7株的突变EPSP合酶赋予细菌细...
【技术保护点】
由编码草甘膦耐受性ＥＰＳＰ合酶的分离的核酸分子组成的组合物，其中所述核酸分子选自下组： ａ）编码ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的变体的核苷酸序列，其中所述变体包含如下一或多个残基： ｉ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸位置７５相对应位置上的半胱氨酸残基； ｉｉ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸位置７６相对应位置上的天冬氨酸残基； ｉｉｉ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸位置７７相对应位置上的天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸残基；ｉｖ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸位置７８相对应位置上的丝氨酸残基； ｖ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸位置８１相对应位置上的丝氨酸或甘氨酸残基； ｖｉ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸位置８２相对应位置上的缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸残基； ｖｉｉ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸位置８６相对应位置上的丙氨酸残基； ｖｉｉｉ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸位置８７相对应位置上的甘氨酸残基； ｉｘ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸位置８８相对应位置上的苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或组氨酸残基； ｘ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸位置９５相对应位置上的丝氨酸、...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2008-2-1 61/025,406书的范 围之内。虽然本文采用了具体术语，但其仅仅是在一般性和描述性意义上使用的，而不是为 了构成限制。本发明涉及调控生物特别是植物或植物细胞的除草剂抗性的组合物和方法。所述 方法包括用编码本发明草甘膦抗性基因的核苷酸序列转化生物体。本发明的核苷酸序列可 用于制备对除草剂草甘膦显示出增加的耐受性的植物。因而，本发明的“草甘膦抗性”或“草 甘膦耐受性”基因旨在指编码SEQ ID NO :7-28中任一所示氨基酸序列的核苷酸序列，及其 编码草甘膦抗性或耐受性多肽的片段和变体。同样，本发明的“草甘膦抗性”或“草甘膦耐 受性”多肽是指具有SEQ ID NO :7-28所示氨基酸序列的多肽，及其赋予宿主细胞草甘膦抗 性或草甘膦耐受性的片段和变体。A.分离的多核苷酸及其变体和片段在一些实施方案中，本发明包括分离的、重组的或纯化的多核苷酸。“分离的”或 “纯化的”多核苷酸或多肽或其生物活性片段，当通过重组技术生产时基本上不含其它细胞 材料或培养基，或当通过化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。“生物活性”表示 拥有天然多肽的期望生物活性，即，保留除草剂抗性活性。“分离的”多核苷酸可以不含在所 述多核苷酸来源生物体的基因组DNA中天然位于所述核酸侧翼的序列(即，位于所述核酸 5’和3’端的序列)(例如，蛋白质编码序列)。出于本发明的目的，“分离的”在用来述及多 核苷酸时不包括分离的染色体。例如，在多个实施方案中，分离的草甘膦抗性编码多核苷酸 可以含有少于约5吐、4吐、3吐、2吐、1吐、0. 5kb或0. lkb的在所述多核苷酸来源细胞的基因 组DNA中天然位于所述多核苷酸侧翼的核苷酸序列。本发明的多核苷酸包括编码作为SEQ ID NO :2和4的变体的草甘膦抗性多肽的那 些多核苷酸。特别是，多核苷酸编码SEQ ID NO :2的变体，在对应于SEQ ID NO :2氨基酸残 基75、77、77、78、81、82、86、87、88和95的位置上具有一个或多个取代，或在对应于SEQ ID NO 4氨基酸位置90、145、350或410的一个或多个位置上具有取代。在一些实施方案中， 变体包含如下一个或多个与SEQ ID NO 2氨基酸位置75相对应位置上的半胱氨酸残基； 与SEQ ID N0:2氨基酸位置76相对应位置上的天冬氨酸残基；与SEQ ID NO 2氨基酸位 置77相对应位置上的天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸残基；与SEQ ID NO :2氨基酸位 置78相对应位置上的丝氨酸残基；与SEQ ID NO 2氨基酸位置81相对应位置上的丝氨酸或甘氨酸残基；与SEQ ID NO :2氨基酸位置82相对应位置上的缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸或苯 丙氨酸残基 ’与SEQ ID NO 2氨基酸位置86相对应位置上的丙氨酸残基；与SEQ ID NO 2 氨基酸位置87相对应位置上的甘氨酸残基；与SEQ ID NO 2氨基酸位置88相对应位置上 的苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或组氨酸残基；与SEQ ID NO :2氨基酸位置95相对应位置上的 丝氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸残基；与SEQ ID NO 2氨基酸位置206相对应位置上的缬氨酸、 丝氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或苏氨酸残基；与SEQ ID NO :2氨基酸位置215相对应位 置上的赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基；与SEQ ID NO :4氨基酸位置90相 对应位置上的异亮氨酸残基；与SEQ ID NO 4氨基酸位置145相对应位置上的谷氨酰胺残 基；与SEQ ID NO 4氨基酸位置350相对应位置上的苏氨酸残基；和与SEQ ID NO 4氨基 酸位置410相对应位置上的甲硫氨酸残基。在多个实施方案中，变体选自SEQ ID NO 7-28 中任一，以及SEQ ID NO 29或30所示的合成核苷酸序列。“草甘膦”表示N-膦酰基甲基甘氨酸(包括其任何盐)的任何除草剂形式以及导 致在植物中(in planta)产生草甘膦阴离子的其他形式。“除草剂抗性蛋白质”或由“除草 剂抗性编码核酸分子”的表达而产生的蛋白质，包括赋予细胞如下能力的蛋白质，即，与不 表达该蛋白质的细胞相比耐受更高浓度除草剂的能力、或与不表达该蛋白质的细胞相比更 长时间地耐受一定浓度的除草剂的能力。“草甘膦抗性蛋白质”包括赋予细胞如下能力的蛋 白质，即，与不表达该蛋白质的细胞相比耐受更高浓度的草甘膦、或与不表达该蛋白质的细 胞相比更长时间地耐受一定浓度的草甘膦的能力。“耐受”或“耐受性”是指，以不易区别于 未处理细胞的方式，存活、或者执行基本细胞功能，例如蛋白质合成和呼吸。本发明还考虑本文所述多核苷酸的变体和片段。多核苷酸的“片段”可以编码多 肽的生物活性部分，或者其可以是能够在本文别处所公开的方法中用作杂交探针或PCR引 物的片段。作为多核苷酸片段的多核苷酸包含至少约15、20、50、75、100、200、300、350、400、 450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、 1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950 个连续核 苷酸，或多达本文所公开的全长多核苷酸中存在的核苷酸数，这取决于目的用途(例如，包 含SEQ ID N0:1的EPSP合酶多核苷酸)。“连续”核苷酸表示彼此紧邻的核苷酸残基。本发明的多核苷酸片段一般将编码保留全长草甘膦抗性蛋白质的生物活性、即除 草剂抗性活性的多肽片段。“保留除草剂抗性活性”是指，片段将具有本文所公开的如SEQ ID NO :2或4的全长草甘膦抗性蛋白质的除草剂抗性活性的至少约30%、至少约50%、至少 约 70 %、至少约 80 %、85 %、90 %、95 %、100 %、110 %、125 %、150 %、175 %、200 %、250 %、 至少约300%或更高。测量除草剂抗性活性的方法在本领域公知。参见例如美国专利 No. 4，535，060和5，188，642，每一篇在此全文并入作为参考。编码本发明多肽的生物活性部分的多核苷酸片段将编码至少约15、25、30、50、75、 100、125、150、175、200、250、300、350、400个连续氨基酸，或多达本发明全长多肽中存在的氨基酸总数。本发明还包括如前文所述的变体多核苷酸。多核苷酸的“变体”还包括编码本文 所公开的多肽、但是由于遗传密码的简并性而存在保守性差别的那些序列，以及足够相同 的那些序列。术语“足够相同”是指，利用比对程序之一，使用标准参数，多肽或多核苷酸序列与9参照序列相比具有至少约60%或65%序列同一性，约70%或75%序列同一性，约80%或 85%序列同一性，约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一 性。本领域技术人员将会意识到，可以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读框定位等 等，适当地调整这些数值，以确定两个多核苷酸所编码的多肽的相应同一性。细菌基因常常在邻近开放读框起点处具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常在这些 起始密码子的一个或多个处的起始翻译会导致产生功能蛋白质。这些起始密码子可以包括 ATG密码子。不过，细菌例如芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)也识别密码子GTG作为起始 密码子，在GTG密码子处起始翻译的蛋白质含有甲硫氨酸作为第一个氨基酸。此外，不是常 常能先验性地确定这些密码子中哪个天然地在细菌中使用。因而，可以理解，这些可选甲硫 氨酸密码子之一的使用可能导致产生赋予除草剂抗性的变体。这些除草剂抗性蛋白质涵盖 在本发明之中，并且可以用在本发明的方法之中。天然存在的等位变体可以用公知的分子生物学技术来鉴定，例如下文所述的聚合 酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸也包括合成来源的、已经例如利用定点或其 他诱变策略生成的、但仍然编码具有期望生物活性的多肽的多核苷酸。技术人员还会理解，可以通过进一步突变本发明的多核苷酸而引入变化，由此引 起所编码多肽的氨基酸序列的进一步变化，而不改变多肽的生物活性。因而，分离的变体多 核苷酸可以通过在编码如本文所公开的EPSP合酶结构域的相应多核苷酸中引入一个或多 个另外的核苷酸取代、添加或缺失而产生，从而在编码的多肽中引入一个或多个氨基酸取 代、添加或缺失。进一步的突变可通过标准技术引入，例如定点诱变和PCR介导的诱变或者 基因改组技术。此类变体多核苷酸也涵盖在本发明之中。变体多核苷酸可以通过沿编码序列的全长或部分随机引入突变(例如通过饱和 诱变)而制备，可以筛选所得突变体赋予除草剂抗性活性的能力，以鉴定保留活性的突变 体。基因改组或有性PCR方法(例如，Smith(1994)Nature 370 :324_325 ；美国专利 No. 5，837，458 ；5, 830, 721 ；5, 811, 238和5，733，731，每一篇都在此并入作为参考)可用来 进一步修饰或增强本文公开的多核苷酸和多肽(例如，赋予草甘膦抗性的多肽)。基因改组 包括随机片段化若干突变体DNA，接着通过PCR将它们重组装成全长分子。多种基因改组方 法的实例包括但不限于在DNA酶处理后组装、交错延伸方法(STEP)以及体外随机引发重 组。在DNA酶介导的方法中，分离自一组阳性突变体的DNA区段以DNasel切割成随机片段， 并进行多轮PCR而不添加引物。随着PCR循环的执行，随机片段的长度接近未切割区段的长 度，导致不同克隆中的突变在一些所得序列中混合和累积。通过多个选择和改组循环，已经 导致了若干酶的功能性增强(Stemmer(1994)Nature 370 :389_391 ；Stemmer(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :10747_10751 ；Crameri 等(1996)Nat. Biotechnol. 14 :315_319 ； Zhang 等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :4504-4509 以及 Crameri 等(1997)Nat. Biotechnol. 15 =436-438)。可对例如编码本文公开多肽的多核苷酸实施此类方法。生成变体的其他方法包括使表达本文公开蛋白质(或其文库)的细胞接触对蛋白 质的活性造成胁迫的特定条件。特定条件可包括(但不限于)温度改变、PH改变、及底物 或抑制剂浓度的改变。蛋白质文库可在蛋白质表达期间(例如在大肠杆菌或其他宿主中)、 或在制备蛋白质提取物之后、或在蛋白质纯化之后接触这些条件。[0030]已经接触过胁迫条件的蛋白质文库的功能或酶促活性可随之与野生型蛋白质进 行比较，以鉴定具有改善性能的蛋白质。活性比较可以作为生长筛选的一部分、或可选地作 为定量蛋白质活性的酶测定法的一部分来实施。可鉴定为改善的性能可以包括草甘膦耐受 性、动力学常数(包括1011、灯^111 )、蛋白质稳定性、蛋白质热稳定性、或蛋白质最适温度的变化。B.分离的蛋白质及其变体和片段除草剂抗性多肽也涵盖在本发明之中。基本上不含细胞物质的除草剂抗性多肽包 括具有少于约30%、20%、10%或5% (以干重计)非除草剂抗性多肽(本文也称为“杂质 蛋白质”)的多肽制品。在本发明中，“除草剂抗性蛋白质”表示本文公开的EPSP合酶多肽。 也提供了其片段、生物活性部分及变体，并且它们可以用来实施本发明的方法。“片段”或“生物活性部分”包括这样的多肽片段，其包含编码除草剂抗性蛋白质的 氨基酸序列的一部分、且保留除草剂抗性活性。例如，除草剂抗性蛋白质的生物活性部分可 以是长度10、25、50、100个或更多氨基酸的多肽。此类生物活性部分可通过重组技术制备， 并评估其除草剂抗性活性。“变体”表示这样的蛋白质或多肽，其具有与SEQ ID NO :7_28中任一至少约60%、 65%、约 70%、75%、约 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的氨基酸序列。本领域技术人员将会意识到，可以考虑密码子简并性、氨基酸相似 性、读框定位等等，对这些数值进行适当的调整，以确定两个多核苷酸所编码的多肽的相应 同一性。例如，可在一个或多个非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。“非必需”氨基 酸残基是能够自多肽野生型序列改变而不影响生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生 物活性所必需的。“保守氨基酸取代”是指将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残 基。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例 如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链 (例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例 如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、3分枝侧链 (例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸) 的氨基酸。可非保守区进行保留功能的氨基酸取代。一般，不对多肽活性所必需的保守氨 基酸残基或位于保守基序中的氨基酸残基进行此取代。不过，本领域技术人员将会理解，功 能变体可以在保守残基处具有微小的保守或非保守改变。本发明也涵盖本发明多肽或其变体或片段的抗体。产生抗体的方法在本领域公知 (参见例如，Harlow 禾口 Lane (1988) Antibodies :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ；美国专利 No. 4，196，265)。C.多核苷酸构建体可修饰编码本发明EPSP合酶多肽的多核苷酸，以获得或增强在植物细胞中的表 达。编码本文鉴定的多肽的多核苷酸可以在表达盒中提供，以用于在目的植物中表达。“植 物表达盒”包括能够引起多核苷酸在植物细胞中表达的DNA构建体，包括重组DNA构建体。 盒可以，按5’ -3’转录方向，包括有效连接于一个或多个目的多核苷酸的在植物中有功能 的转录起始区域(即启动子，尤其是异源启动子)，和/或翻译及转录终止区(即终止区)。盒可以另外含有至少一个待引入生物体的其他多核苷酸，例如可选择标记基因。可选地，该 其他多核苷酸可以在多个表达盒上提供。这样的表达盒提供有多个限制性位点，用来插入 多核苷酸，使之处于调控区域的转录调控之下。“异源”一般指，多核苷酸或多肽并非细胞内源的、或者对于其所存在于的天然 基因组中的位置而言并非内源的，并且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微粒轰击 (microprojection)等而添加到细胞中。“有效连接”表示两个多核苷酸之间的功能性连 接。例如，当启动子有效连接于DNA序列时，启动子序列起始和介导DNA序列的转录。公认， 有效连接的多核苷酸可以是或者可以不是连续的，并且当用来述及两个多肽编码区的连接 时，所述多肽在相同的读框中表达。启动子可以是在选择的植物细胞、植物部分或植物中显示出转录活性的任何多核 苷酸序列。启动子对于植物宿主和/或本发明的DNA序列可以是天然的或同源的、或者外 来的或异源的。启动子对于植物宿主是“天然的”或“同源的”，表示启动子见于该启动子 所引入的天然植物中。启动子对于本发明的DNA序列是“外来的”或“异源的”，表示启动 子对于有效连接的本发明DNA序列并非是天然的或天然存在的启动子。启动子可以是诱导 型或组成型的。其可以是天然存在的，可以由多个天然存在启动子的部分组成，或者可以 部分或全部是合成的。通过启动子结构的研究提供了启动子的设计指南，例如Harley和 Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15 :2343_2361。此外，可以优化启动子相对于转录起 点的定位。参见例如 Roberts 等(1979)Proc. Natl. Acad. Sci. USA，76 :760_764。许多在植 物中使用的适宜启动子在本领域公知。例如，在植物中使用的适宜组成型启动子包括来自植物病毒的启动子，例如花生 退绿条死病花椰菜花叶病毒(PC1SV)启动子(美国专利No. 5，850，019)；来自花椰菜花叶 病毒(CaMV)的35S启动子(Ode 11等(1985)Nature 313 :810_812)；小球藻病毒甲基转移 酶基因的启动子(美国专利No. 5，563，328)以及来自玄参花叶病毒(FMV)的全长转录物 启动子(美国专利No. 5，378，619)；来自诸如稻肌动蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2:163-171)；泛素(Christensen 等(1989)Plant Mol. Biol. 12 :619_632 和 Christensen 等(1992)Plant Mol. Biol. 18 :675_689) ；pEMU(Last 等(1991)Theor. Appl. Genet. 81 581-588) ；MAS(Velten等(1984)EMB0 J. 3 :2723_2730)；玉米H3组蛋白(L印etit等(1992) Mol.Gen.Genet. 231:276-285and Atanassova 等(1992)Plant J. 2(3) :291_300)；欧洲 油菜(Brassica napus) ALS3 (PCT申请W0 97/41228)等基因的启动子；以及各种农杆菌 (Agrobacterium)基因的启动子(参见美国专利 No. 4，771，002 ；5，102，796 ；5，182，200 ；和 5，428，147)。在植物中使用的适宜诱导型启动子包括来自ACE1系统的响应铜的启动子(Mett 等(1993)PNAS 90:4567-4571)；玉米In2基因的响应苯磺酰胺除草剂安全剂的启动子 (Hershey 等(1991)Mol. Gen. Genetics227 :229_237 和 Gatz 等(1994)Mol. Gen. Genetics 243:32-38)；以及来自 Tn 10 Tet 阻遏物的启动子(Gatz 等(1991)Mol. Gen. Genet. 227 229-237)。在植物中使用的另一种诱导型启动子是响应植物通常不响应的诱导剂的启动 子。例示性的此类诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性受 糖皮质激素诱导(Schena 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 10421)；或最近应用的 嵌合转录激活物XVE，用于受雌二醇激活的、基于雌激素受体的诱导型植物表达系统(Zuo等(2000) Plant J.，24 :265_273)。其他在植物中使用的诱导型启动子在EP 332104、PCT W093/21334和PCT W0 97/06269中描述，在此将其整体并入并入作为参考。还可以使用由 其他启动子的部分组成的启动子，以及部分或全部合成的启动子。参见例如Ni等(1995) Plant J. 7 :661-676和PCT W0 95/14098，描述了在植物中使用的此类启动子。启动子可以包括，或者经修饰而包括，一个或多个增强子元件。在一些实施方案 中，启动子可以包括多个增强子元件。含有增强子元件的启动子与不含它们的启动子相比 可以确保更高水平的转录。在植物中使用的适宜增强子元件包括PC1SV增强子元件(美国 专利 No. 5，850, 019)、CaMV35S增强子元件(美国专利No. 5，106, 739和 5，164，316)以及FMV 增强子元件(Maiti 等(1997) Transgenic Res. 6 143-156)。还请参见 PCT W096/23898。通常此类构建体可以含有5’和3’非翻译区。此类构建体可以含有“信号序列” 或“前导序列”以利于目的肽向某个细胞内结构如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基 体的共翻译或翻译后转运，或者分泌。例如，可以工程化设计构建体以含有信号肽，以利于 肽转运到内质网。“信号序列”是指，已知会或者怀疑会引起跨细胞膜的共翻译或翻译后肽 转运的序列。在真核细胞中，这一般涉及分泌到高尔基体中以及由此的一定糖基化。“前导 序列，，是指，任何在翻译后产生如下氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列足以触发肽链共翻 译转运到亚细胞器。因而，这包括通过穿运进入内质网、进入液泡、质体(包括叶绿体)、线 粒体等而靶向转运和/或糖基化的前导序列。还可以优选工程化设计植物表达盒以含有内 含子，以便内含子的mRNA加工是表达所必需的。“3’非翻译区”表示位于编码序列下游的多核苷酸。多聚腺苷酸化信号序列及其他 编码能够影响多聚腺苷酸尾添加到mRNA前体3’端的调控信号的序列是3’非翻译区。“5’ 非翻译区”表示位于编码序列上游的多核苷酸。其他上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是发挥作用以增加启动子区表达 的多核苷酸。增强子在本领域公知，并且包括但不限于SV40增强子区和35S增强子元件。终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对本发明的序列而言是天然的， 或者可以来自其他来源。便利的终止区可以来自根癌农杆菌(A.tumefaciens)!!质粒，例 如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。参见例如Guerineau等(1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ；Proudfoot(1991)Cell64 671-674 ；Sanfacon 等(1991)Genes Dev. 5 141-149 ； Mogen 等(1990)Plant Cell 2 1261-1272 ;Munroe 等(1990)Gene 91 151-158 ；Ballas 等(1989)Nucleic Acids Res. 17 :7891_7903 和 Joshi 等(1987)NucleicAcidRes. 15 9627-9639。在本发明的一方面，针对给定多肽，例如本发明的多肽，设计合成的DNA序列。合 成DNA序列的开放读框在细胞中的表达导致产生本发明的多肽。合成DNA序列可用于简单 地去除不想要的限制性核酸内切酶位点以利于DNA克隆策略，改变或去除任何潜在的密码 子偏好，改变或改善GC含量，去除或改变可变读框，和/或改变或去除可能存在于天然DNA 序列之中的内含子/外显子剪接识别位点、多聚腺苷酸化位点、Shine-Delgarno序列、不 想要的启动子元件等等。也有可能合成的DNA序列可以用来向DNA序列中引入其他改进， 例如引入内含子序列、创建以与细胞器靶向序列(例如叶绿体转运肽、质外体/液泡靶向 肽、或导致所得肽滞留在内质网中的肽序列)融合的蛋白质形式表达的DNA序列。合成的 基因还可以利用宿主细胞偏好的密码子合成以提高表达，或者以宿主偏好的密码子使用频率使用密码子合成。参见例如Campbell和Gowri (1990)Plant Physiol. 92 :1_11 ；美国专 利 No. 6，320，100 ；6，075，185 ；5，380，831 和 5，436，391，美国公开申请 No. 20040005600 和 20010003849，以及 Murray 等(1989)Nucleic Acids Res. 17 :477_498，在此并入作为参考。在一个实施方案中，目的多核苷酸靶向叶绿体进行表达。在这种方式中，在目 的多核苷酸不直接插入到叶绿体中的情况下，表达盒将另外含有编码转运肽的多核苷酸 以指导目的核苷酸进入叶绿体。这样的转运肽在本领域已知。参见例如Von Heijne等 (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9 104-126 ；Clark 等(1989) J. Biol. Chem. 264 17544-17550 ； Della-Cioppa 等(1987)Plant Physiol. 84 :965_968 ;Romer 等(1993)Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 :1414-1421 和 Shah 等(1986)Science 233 :478_481。可以考虑植物细胞核和该细胞器之间密码子使用的差异，对待靶向叶绿体的目的 多核苷酸进行优化以在叶绿体中表达。在这种方式中，目的多核苷酸可以利用叶绿体偏好 的密码子来合成。参见例如美国专利No. 5，380，831，在此并入作为参考。该植物表达盒可以插入到植物转化载体中。“转化载体”表示允许转化细胞的DNA 分子。这样的分子可以由一个或多个表达盒组成，并且可以组织成一个以上的载体DNA分 子。例如，双元载体是植物转化载体，利用两个不连续的DNA载体编码转化植物细胞所必 需的所有顺式和反式功能(Hellens 和 Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5 446-451)。“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的多核苷酸构建体。“表达载体” 是指具有在外来细胞中掺入、整合和表达异源DNA序列或片段的能力的载体。植物转化载体包括一个或多个用于实现植物转化的DNA载体。例如，本领域常见 的做法是利用含有一个以上连续DNA区段的植物转化载体。这些载体在本领域往往称为双 元载体。双元载体以及伴有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转 化所需的DNA区段的大小和复杂度相当大，故而将功能分割到分开的DNA分子上是有利的。 双元载体一般包括这样的质粒载体，其含有T-DNA转移所需的顺式作用序列(例如左边界 和右边界)、经工程化设计能够在植物细胞中表达的可选择标记、以及“目的多核苷酸”(经 工程化设计能够在期望生成转基因植物的植物细胞中表达的多核苷酸)。还存在于该质粒 载体上的有细菌复制所需的序列。这些顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞中并在 其中表达的方式排列。例如，可选择标记序列和目的序列位于左右边界之间。通常第二质 粒载体含有介导T-DNA从农杆菌转移到植物细胞中的反式作用因子。该质粒往往含有毒 力功能(Vir基因)，允许农杆菌感染植物细胞，并通过边界序列处的切割和vir介导的DNA 转移而转移DNA，如本领域所理解的那样(Hellens和Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5 :446_451)。若干类型的农杆菌菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105 等)可用于植物转化。第二质粒载体对于通过其他方法例如微粒轰击、显微注射、电穿孔、 聚乙二醇等向植物中引入多核苷酸而言并不是必需的。D.植物转化本发明的方法包括向植物中引入核苷酸构建体。“引入”表示以构建体获得进入 植物细胞内部的方式将核苷酸构建体呈递给植物。本发明的方法不要求使用特定的方法将 核苷酸构建体引入到植物中，仅仅是要求核苷酸构建体获得进入植物的至少一个细胞的内 部。将核苷酸构建体引入到植物中的方法在本领域已知，包括但不限于稳定转化方法、瞬时 转化方法以及病毒介导的方法。[0055]一般而言，植物转化方法包括将异源DNA转移到靶植物细胞中(例如，未成熟或成 熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，接着施加最大阈值水平的适宜选择 (取决于可选择标记基因，在本案中是“草甘膦”)，以从未转化的细胞团中回收转化的植物 细胞。外植体一般被转移到新鲜供应的相同培养基中并常规培养。随后，转化的细胞在置于 补充有最大阈值水平选择剂(例如“草甘膦”)的再生培养基中之后分化出芽。芽随之转移 到选择性生根培养基中，以回收生根的芽或小植株。转基因小植株随之长成成熟植株，并产 生可育种子(例如 Hiei 等(1994) The Plant Journal6 :271_282 ；Ishida 等(1996) Nature Biotechnology 14 :745_750)。外植体一般转移到新鲜供应的相同培养基中并常规培养。 有关生成转基因植物的技术和方法的一般说明见Ayres和Park (1994) Critical Reviews in PlantScience 13 :219_239 以及 Bommineni 禾口 Jauhar (1997)Maydica 42:107—120。由 于转化的材料含有许多细胞；转化的以及未转化的细胞皆存在于任何一块的靶受试愈伤组 织或者组织或细胞群中。杀死未转化的细胞并允许转化的细胞增殖的能力将导致转化的植 物培养物。通常，去除未转化细胞的能力对于快速回收转化的植物细胞和成功生成转基因 植物是一种限制。可利用分子和生化方法来确认转基因植物基因组中整合的异源目的基因 的存在。生成转基因植物可以通过若干方法之一来实施，包括但不限于，通过农杆菌将异 源DNA引入到植物细胞之中(农杆菌介导的转化)、用附于粒子上的异源外来DNA轰击植 物细胞、以及多种其他非粒子直接介导的方法(例如，Hiei等(1994)The Plant Journal 6 271-282 ；Ishida 等(1996)NatureBiotechnology 14 745-750 ；Ayres 和 Park(1994) Critical Reviews in PlantScience 13 219~239 ；Bommineni 禾口 Jauhar(1997)Maydica 42 :107-120)以转移 DNA。叶绿体转化方法在本领域已知。参见例如Svab等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 8526-8530 ；Svab 和 Maliga(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :913_917 ；Svab 和 Maiiga (1993) EMB0 J. 12 :601_606。该方法依赖于基因枪递送含可选择标记的DNA，以及通 过同源重组使DNA靶向该质体基因组。另外，质体转化可通过核编码的、质体定向的RNA聚 合酶的组织偏好型表达，通过反式激活沉默的质体携带的转基因而实现。这样的系统已经 在 McBride 等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :7301_7305 中报道。已经转化的细胞可以按照常规方法培养成植物。参见例如McCormick等(1986) Plant Cell Reports 5 :81_84。随之可以生长这些植物，并用相同的转化的株系或不同的 株系授粉，鉴定组成型表达期望的表型特征的所得杂种。可以栽培两代或更多代，以确保该 期望表型特征的表达得以稳定维持和遗传，然后收获种子以确保已经实现期望表型特征的 表达。以这种方式，本发明提供了具有稳定掺入至其基因组中的本发明核苷酸构建体[例 如本发明的表达盒]的转化的种子(也称为“转基因种子”)。E.植物转化评价在将异源外来DNA引入到植物细胞中之后，该异源基因在植物基因组中的转化或 整合可以通过多种方法来确认，例如分析与整合基因相关的核酸、蛋白质以及代谢物。PCR分析是一种在移植入土壤之前的较早阶段筛选存在掺入的基因的转化细 胞、组织或芽的快速方法(Sambrook 禾口 Russell (2001)MolecularCloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY))。PCR 利用特异于目的基因或农杆菌载体背景等的寡核苷酸引物进行。植物转化可以通过基因组DNA的Southern印迹分析来确认(Sambrook和 Russell (2001)同前)。一般而言，从转化株中提取总DNA，用适宜的限制性酶消化，在琼脂 糖凝胶上分级分离，并转至硝基纤维素或尼龙膜上。膜或“斑点”随之可以按照标准技术用 例如放射标记的32P靶DNA片段探测，以确认引入基因在植物基因组中的整合(Sambrook和 Russell, 2001,同前)。在Northern分析中，按照本领域常规使用的标准方法，从转化株的特定组织中分 离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中分级分离，并印迹到尼龙滤膜上(Sambrook和Russell (2001) 同前)。本发明grg序列所编码的RNA的表达随之可以利用本领域已知的方法通过使滤膜 与源自⑶C的放射性探针杂交来检验(Sambrook和Russell (2001)同前)。可以通过标准方法(Sambrook和Russell (2001)同前)，利用与除草剂抗性蛋白质 上存在的一个或多个表位结合的抗体，对转基因植株进行Western印迹和生化测定等，以 确定除草剂抗性基因所编码的蛋白质的存在。在本发明的一个方面，本文所述的grg基因可用作标记来评估细菌或植物细胞的转化。F.植物和植物部分“植物”是指，整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、 胚及其子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质 体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。本发明可以用来将多核苷酸引入到任何植物物种 中，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的实例包括但不限于玉米(玉蜀 黍)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、 甘蔗、烟草、大麦、和油菜籽油菜、芸苔属物种(Brassicasp.)、苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、 甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘属果树、可可、茶树、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄 榄、木瓜、腰果、澳大利亚坚果、杏、燕麦、蔬菜类、观赏植物类以及针叶树类。蔬菜类包括但不限于番茄、莴苣、绿豆、菜豆、豌豆、以及甜瓜属(Curcumis)的成 员，例如黄瓜、甜瓜和香瓜。观赏植物类包括但不限于杜鹃、绣球属植物、木槿属植物、蔷薇 属植物、郁金香属植物、水仙、矮牵牛属植物、康乃馨、大戟属植物和菊属植物。作物植物也 有重要意义，包括例如玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃 薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜籽油菜等。本发明适合于任何单子叶植物家族的成员，包括但不限于玉蜀黍、稻、大麦、燕 麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、薯蓣、洋葱、香蕉、椰子和枣。G.增加植物产量的方法本发明提供了增加植物产量的方法。所述方法包括向植物或植物细胞中引入含本 文所公开的grg序列的多核苷酸。如本文所定义的那样，植物“产量”是指植物所产生的生 物质的质量和/或数量。“生物质”是指任何测量到的植物产品。生物质产出的增加可以是 所测量的该植物产品的产量方面的任何改进。增加的植物产量具有若干商业应用。例如， 增加植物叶生物质可以增加人或动物所消耗的叶类蔬菜的产量。另外，可以通过增加叶生 物质，增加植物来源的药用或工业产品的产出。产量增加可以包括任何统计学显著的增加， 包括但不限于至少的增加、至少3%的增加、至少5%的增加、至少10%的增加、至少1620%的增加、至少30%、至少50%、至少70%、至少100%或更高的增加。在特定方法中，用有效浓度的除草剂处理植物，其中除草剂施用导致增强的植物 产量。“有效浓度”表示允许植物产量增加的浓度。目的除草剂的此类有效浓度在本领域普 遍已知。可以在出苗前或者出苗后，按照除草剂施用的通常技术对大田施用除草剂，所述大 田包含已经因异源表达本发明的grg基因而对除草剂具有抗性的作物。本发明还提供了对植物或植物部分赋予除草剂抗性的方法。在此类方法中，将本 文公开的grg多核苷酸引入到植物中，其中多核苷酸的表达导致草甘膦耐受性或抗性。借 助该方法产生的植物能够用有效浓度的除草剂处理，并展示出对该除草剂的增加的耐受 性。本申请中除草剂的“有效浓度”是足以使天然不具有除草剂抗性或未曾被赋予除草剂 抗性的植物或植物部分的生长减慢或停止的量。H.控制大田中杂草的方法本发明还提供了选择性地控制含植物的大田中的杂草的方法。在一个实施方案 中，植物种子或植物由于所述植物种子或植物中插入了本文公开的grg多核苷酸而为草甘 膦抗性的。在一个特定方法中，用有效浓度的除草剂处理植物，其中除草剂施用导致选择性 地控制杂草或其他未转化的植物。“有效浓度，，是指，控制杂草或其他未转化植物的生长或 扩散、而不会显著影响草甘膦抗性植物或植物种子的浓度。目的除草剂的此有效浓度在本 领域普遍已知。可以在出苗前或者出苗后，按照除草剂施用的通常技术，对大田施用除草 剂，其中所述大田包含已经被赋予了抗除草剂抗性的植物或植物种子。I.温度谱已经进行了植物中草甘膦代谢的若干研究，并揭示植物不代谢草甘膦或者代谢 极其缓慢。草甘膦可以迅速穿透角质层，并经过一个相当长的时间转移到整个植株(在 Kearney 禾口 Kaufman 编辑(1988)Herbicides ；Chemistry, Degradation & Mode of Action Marcel Dekker, Inc.，New York, 3 :1_70，以及 Grossbard 禾口 Atkinson 编辑(1985)The Herbicide GlyphosateButterworths，London，25-34 页中综述)。因而，很可能在农业经济 意义植物中在接触草甘膦后持续的一段时间内草甘膦耐受性是必要的。在生长季期间温度 频繁超过30°C的情况下，采用在升高温度时维持活性的草甘膦耐受性EPSP合酶将是有利 的。在本发明的一个实施方案中，EPSP合酶在高于或低于周围环境温度的温度时呈现 出热稳定性。“热稳定性”表示酶在高于或低于周围环境温度的温度时比在该温度并非热稳 定的EPSP合酶在更长的时...
【专利技术属性】
技术研发人员：V海因里希斯，LC斯考滕，B范迪博格，
申请(专利权)人：阿森尼克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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