本发明专利技术提供了用于赋予针对细菌、植物、植物细胞、组织以及种子的杀虫活性的组合物和方法。提供了包括一种针对毒素多肽的编码序列的组合物。这些编码序列可以用在DNA构建体或表达盒中用于在植物和细菌中进行转化和表达。组合物还包括经转化的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子。特别是提供了分离的毒素核酸分子。此外，包括相应于这些多核苷酸的氨基酸序列，以及特异性结合到这些氨基酸序列上的抗体。具体而言，本发明专利技术提供了分离的核酸分子，这些核酸分子包括对SEQ ID NO：2或3中所示的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列，或在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸序列，连同它们的变体以及片段。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】AXMI277线虫毒素及其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2011年6月30日提交的美国临时申请序列号61/503,132的权益，其内容通过引用以其全文结合在此。电子提交的序列表的引用序列表的这个正式拷贝是通过EFS-Web以电子方式提交的一个ASCII格式序列表，文件命名为“2916693-094977-SEQLIST.txt”，创建于2012年6月28日，大小为21.4千字节，并且与本说明书同时提交。包含在这个ASCII格式文件中的该序列表是本说明书的一部分，并且通过引用以其全文结合在此。专利
本专利技术涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新颖的基因。这些蛋白质和编码它们的这些核酸序列在杀虫配制品的制备以及转基因抗害虫植物的生产中是有用的。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌是一种形成革兰氏阳性孢子的土壤细菌，其特征在于它具有产生结晶内含物的能力，这些结晶内含物对某些目和物种的昆虫是具有特异毒性的，但是对植物以及其他非靶向的生物是无害的。由于这种原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫(insecticidal)蛋白的组合物可以用作环境可接受的杀虫剂来控制农业的虫害或针对多种的人或动物疾病的媒虫。来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目的、半翅目的、双翅目的、以及鞘翅目的幼虫的有效的杀昆虫活性。这些蛋白质还已经显示对抗膜翅目、同翅目、虱目、食毛目、以及螨害虫目、连同其他无脊椎动物目(如线虫动物门、扁形动物门、以及原生动物门肉鞭毛虫亚门)的活性(Feitelson(斐特尔森)(1993)TheBacillusThuringiensisfamilytree(苏云金芽孢杆菌家族树).在AdvancedEngineeredPesticides(《高级工程化杀虫剂》)中,MarcelDekker,Inc.(马塞尔·德克公司),纽约市,纽约州)这些蛋白质主要基于它们的杀昆虫活性最初被分类为CryI至CryV。这些主要的类别是鳞翅类特异的(I)、鳞翅类与双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)、以及线虫特异的(V)与(VI)。这些蛋白质进一步被分类为亚家族，每个家族之内更加高度相关的蛋白质被分配了分组字母，如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。在每个组之内的甚至更加紧密相关的蛋白质被给予名称，如Cry1C1，Cry1C2等。最近说明了对于这些Cry基因的一种基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性的新命名法(Crickmore(克里克莫尔)等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.(《微生物分子生物学综述》)62:807-813)。在这种新式分类中，每种毒素被分配了一个独特的名称，该名称结合了一个第一列(一个阿拉伯数字)，一个第二列(一个大写体字母)、一个第三列(一个小写字母)、以及一个第四列(另一个阿拉伯数字)。在这种新式分类中，在该第一列中罗马数字已经换成了阿拉伯数字。具有小于45％的序列一致性的蛋白质具有不同的第一列，并且对于第二和第三列的指标对应地是78％和95％。该晶体蛋白直到它已经被昆虫摄取并且在昆虫的肠中溶解时才显示出杀昆虫活性。被摄取的原毒素在昆虫的消化道中被蛋白酶水解为一种活性有毒分子(andWhiteley(1989)Microbiol.Rev.(《微生物综述》)53:242-255)。这种毒素在该目标幼虫的中肠中与顶端的刷状缘受体相结合，并且插到该顶膜中产生了离子通道或孔，导致幼虫的死亡。δ-内毒素总体上具有五个保守序列结构域，以及三个保守结构域(参见例如，deMaagd等人(2001)TrendsGenetics(《遗传学趋势》)17:193-199)。第一保守结构域由7个α螺旋组成，并且参与膜插入与孔形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的三个β折叠组成，并且结构域III由“果冻卷饼”形式下的两个反向平行β折叠组成(deMaagd等人,2001,同上)。结构域II和III参与了受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。由于昆虫可以带来的灾害，以及通过控制虫害在产量方面的改进，存在着一种发现新形式的杀虫毒素的不断需求。
技术实现思路
提供了用于赋予针对细菌、植物、植物细胞、组织以及种子的杀虫活性的组合物和方法。组合物包括针对杀虫(pesticidal)的和杀昆虫(insectidal)多肽的核酸分子编码序列、包括那些核酸分子的载体、以及包括这些载体的宿主细胞。组合物还包括这些杀虫多肽序列以及针对那些多肽的抗体。这些核苷酸序列可以用在DNA构建体或表达盒中以用于在多种生物(包括微生物和植物)中进行转化和表达。这些核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，这些合成序列已经被设计为用于在一种生物中表达，该生物体包括但不局限于：一种微生物或一种植物。组合物还包括含有本专利技术的核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织以及种子。具体而言，提供了分离的核酸分子，这些核酸分子编码一种杀虫蛋白。此外，涵盖了与这些杀虫蛋白相对应的氨基酸序列。具体而言，本专利技术提供了一种分离的或重组的核酸分子，该核酸分子包括对SEQIDNO:2或3中所示的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列，或在SEQIDNO:1中列出的核苷酸序列，连同它们的生物活性的变体以及片段。还涵盖了与本专利技术的一个核苷酸序列互补的核苷酸序列、或与本专利技术的一个序列杂交的核苷酸序列或其互补物。进一步提供了载体、宿主细胞、植物以及种子，这些载体、宿主细胞、植物以及种子包括本专利技术的这些核苷酸序列，或对本专利技术的这些氨基酸序列进行编码的核苷酸序列，连同它们的生物活性的变体以及片段。提供了用于产生本专利技术的多肽的方法，以及用于使用这些多肽来控制或杀死一种鳞翅目的、半翅目的、鞘翅目的、线虫目的、或双翅目的害虫的方法。还包括了用于在一个样品中检测本专利技术的这些核酸和多肽的方法和试剂盒。本专利技术的这些组合物和方法对于产生具有增强的害虫抗性或耐受性的生物是有用的。这些生物以及包括这些生物的组合物对于农业目的是所希望的。本专利技术的这些组合物还对于产生改变的或改进的具有杀虫活性的蛋白质、或对于在产物或生物中检测杀虫蛋白或核酸的存在是有用的。本专利技术描绘了用于调节生物(特别是植物或植物细胞)中的害虫抗性或耐受性的组合物和方法。“抗性”一词是指该害虫(例如，昆虫)一旦摄取或以其他方式接触本专利技术的多肽类时就被杀死。“耐受性”一词是指该害虫的运动、摄食、繁殖、或其他功能的损害或降低。这些方法涉及用编码了本专利技术的一种杀虫蛋白的一个核苷酸序列来转化生物。特别是，本专利技术的核苷酸序列对于制备具有杀虫活性的植物和微生物是有用的。因此，提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。组合物是杆菌或其他物种的杀虫的核酸以及蛋白质。发现这些序列在用于随后转化入感兴趣的生物体中的表达载体的构建方面用作探针用于其他同源(或部分同源的)基因的分离，以及用于通过本领域中已知的方法(如，结构域交换或DNA改组)来产生改变的杀虫蛋白，例如，采用内毒素的Cry1、Cry2以及Cry9家本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组核酸分子，包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码一个具有杀虫活性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列是选自下组，该组由以下各项组成：a)在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列；b)一个编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包括SEQ ID NO：2或3中任一者的氨基酸序列；c)一个编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包括一个具有与SEQ ID NO：2或3中任一者的氨基酸序列至少95%的序列一致性的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组核酸分子，由编码氨基酸序列为SEQIDNO:2或3的杀虫多肽的核苷酸序列组成。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中，所述核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是已经被设计为用于在植物中表达的合成序列。
4.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列可操作地连接于能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中进行表达的启动子。
5.一种载体，包括如权利要求1所述的重组核酸分子。
6.一种细菌宿主细胞，该细菌宿主细胞包含如权利要求1所述的重组核酸分子。
7.一种具有杀虫活性的重组多肽，该重组多肽由SEQIDNO:2或3的氨基酸序列组成。
8.一种组合物，包括如权利要求7所述的多肽。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述组合物选自粉末、粉尘、颗粒、喷雾、乳液、胶体以及溶液。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述颗粒为小粒。
11.如权利要求8所述的组合物，其中所述组合物通过细菌细胞培养物的干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩而制备。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述干燥为冷冻干燥。
13.如权利要求8所述的组合物，包括按重量计为1％至99％的所述多肽。
14.一种用于控制鳞翅目的、半翅目的、鞘翅目的、线虫目的或双翅目的害虫种群的方法，包括将所述种群与杀虫有效量的如权利要求7所述的多肽进行接触。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：坎迪斯·普特，西奥多·W·卡恩，艾利萨·安东尼，
申请(专利权)人：阿森尼克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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