本发明专利技术公开了一种低能离子注入介导Ri质粒转化诱导黄芩毛状根的方法，主要是利用低能离子注入介导技术高效、定向地将Ri质粒导入黄芩外植体中，促使Ri质粒与黄芩基因组发生重组整合，实现诱导黄芩毛状根的目的，所得的黄芩毛状根形态上多丛生，分枝多，无向地性，能够不依赖激素快速生长，能稳定生物合成黄芩苷，诱导率可达20～55％，黄芩苷含量可达16.47～19.56％。本发明专利技术提供的方法不仅操作简便，适用范围更广泛，将为单子叶植物及裸子植物的毛状根体系建立奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，主要是利用低能离子注入介导技术高效、定向地将Ri质粒导入黄芩外植体中，促使Ri质粒与黄芩基因组发生重组整合，实现诱导黄芩毛状根的目的，所得的黄芩毛状根形态上多丛生，分枝多，无向地性，能够不依赖激素快速生长，能稳定生物合成黄芩苷，诱导率可达20～55％，黄芩苷含量可达16.47～19.56％。本专利技术提供的方法不仅操作简便，适用范围更广泛，将为单子叶植物及裸子植物的毛状根体系建立奠定基础。【专利说明】
本专利技术属于黄芩的人工培育
，具体涉及一种黄芩毛状根的诱导方法。
技术介绍
药物植物被发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染后,在伤口处就会形成不定根，不定根除菌后能迅速生长，并产生多个分枝，呈毛发状，该不定根又被称为毛状根(Hairy roots)。自1907年Smith和Townsend发现发根农杆菌能诱导植物形成毛状根后，1930年Riker等再次阐述了该现象。随着植物生物技术的发展，有关毛状根的研究进展十分迅速，除了探求外源基因导入植物细胞的机制和植物激素的生理效应外，应用毛状根生物技术诱导植物次生代谢产物的形成与生物转化等研究也有很大发展。到20世纪末，国内外学者已建立了分属于31个科的100余种植物的毛状根培养体系，并进行次级代谢产物的生产和调控,包括苷类、生物碱、醌类、芳香油、酚类、黄酮等多种天然产物。毛状根培养技术已被认为是生产药用植物次生代谢产物的一条重要途径，具有非常广泛的应用前景。发根农杆菌之所以具有这种致根性，是因为它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒。Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250kb的大质粒，带有冠瘿合成酶基因。在Ri质粒上，存在与转化有关的 两个主要功能区，即T-DNA (转移区)和Vir (致病区)。Vir区基因并不发生转移，但它对T-DNA的转移非常重要。当发根农杆菌感染植物时Ri质粒上的T-DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。Ri质粒诱导的发根具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定，分化程度高、不易变异等特点，而且可把二次代谢物分泌至培养基中。尽管发根培养技术应用于植物次生代谢生产的历史较短，但该技术发展迅速，特别是在一些有价值的药用植物次生代谢产物的生产上，但是该技术在推广过程中遇到了一些问题，如有些植物发根难以诱导，尤其是单子叶植物和裸子植物，这主要归因于发根农杆菌对这些植物的侵染能力较弱，致使处于发根农杆菌体内的Ri质粒不能转入到植物体内；同时，利用发根农杆菌诱导产生毛状根后，必须尽快除去毛状根吸附的发根农杆菌，使毛状根在无菌条件下生长。针对这些问题，亟需开发一种高效的转Ri质粒诱导毛状根的方法。低能离子注入技术是20世纪80年代由我国科学家余增亮研究员等人开创和拓展的多学科交叉的新兴研究技术，目前已被广泛运用于生物品种改良。在此基础上，我国学者自主开发了低能离子注入介导的转基因技术。作为一种新的转基因方法，低能离子注入介导的转基因技术有其自身的特点:(1)注入离子对细胞具有极强的刻蚀作用，致使细胞表面形成可使外源DNA进入的通道，加上由于注入正离子的积累，大大降低了细胞表面的负电性，从而减少了细胞对带负电的外源DNA的静电排斥力，提高了外源DNA的导入。(2)低能离子注入介导转入的外源DNA是直接整合入宿主总DNA中，因此具有较好的遗传稳定性。(3)低能离子注入介导的转基因技术是通过将能量较高的离子射入生物体内，通过能量沉积、质量沉积和电荷交换的机制使生物体产生自由基、染色结构变异或者DNA分子的断裂、碱基插入、缺失、重复等生物学效应而产生生物突变体。目前，低能离子注入介导外源DNA转化无论在理论上还是实际应用上都取得了显著成果。目前尚未见将低能离子注入转基因方法运用于诱导药用植物毛状根的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种。为达到上述目的，本专利技术 采用了以下技术方案:I)将黄芩外植体转接到含50~200 μ g/mL乙酰丁香酮的MS固体培养基中，转接后于25~28°C黑暗培养2~3天，培养后用无菌水将黄芩外植体表面的培养基冲洗干净，冲洗干净后将黄芩外植体表面的无菌水用无菌风吹干，吹干后在黄芩外植体上划痕；2)经过步骤I)后，将黄芩外植体放置于离子注入机的真空靶室内，然后对黄芩外植体进行低能离子注入；3)将经过低能离子注入的黄芩外植体浸泡入含Ri质粒的TE缓冲溶液中并进行避光温育，温育的时间为2~4h,温育的温度为25~28°C,然后将黄岑外植体接种于含0.1~0.5mg/L吲哚-3- 丁酸的MS固体培养基中，接种后于25~28°C黑暗培养21~25天诱导出毛状根。所述黄芩外植体为切成0.5~1.0cm的黄芩带节茎段的碎段。所述含Ri质粒的TE缓冲溶液中Ri质粒的浓度为≥200 μ g/mL。所述离子注入的条件为:以N+作为注入离子，最佳注入剂量为2.5X1016~3.5X 1016ions/cm2，最佳注入能量为25~30KeV,脉冲时间为5~IOs,间隔时间为5~IOs,真空度为1.5~2.0XlO-4Pa0本专利技术具有以下有益的技术效果:1、本专利技术所述诱导黄芩毛状根的方法通过低能离子注入介导的Ri质粒诱导黄芩属黄岑得到毛状根，结合基因间隔序列(intergenic transcribed spacer, ITS)基因检测分析，鉴定所得毛状根为黄芩属黄芩毛状根，诱导率可达20~55%，在液体培养基培养后，所得黄芩毛状根呈黄色，能稳定生物合成黄芩苷，黄芩苷含量可达16.47~19.56%。2、本专利技术所述诱导黄芩毛状根的方法基于Ri质粒转化植物后，Ri质粒上的T-DNA片段整合入植物细胞核基因组中，使植物外植体产生毛状根的原理。与现有技术的不同之处在于，本专利技术所述Ri质粒转化方法是利用低能离子注入技术对植物表面具有高效冷刻蚀作用的特点，将来源于农杆菌的Ri质粒高效导入黄芩外植体中，诱导黄芩毛状根的生成，解决了现有技术只能依靠发根农杆菌对植物自然侵染能力的大小实现转移Ri质粒进行诱导毛状根的目的，提高了黄芩毛状根诱导的高效性，为黄芩毛状根的诱导开辟出一条有效途径。3、本专利技术所述诱导黄芩毛状根的方法不需要发根农杆菌与植物外植体共培养，毛状根也无需脱菌处理，解决了毛状根诱导过程中，植物外植体与农杆菌共培养时间过长或过短引起植物细胞受到毒害而死亡的问题，操作简便，诱导效率得到提高。4、对于步骤I)至步骤3)，现有技术中利用低能离子介导转化质粒(或基因片断)的相关研究表明，影响转化率的因子有离子的能量、剂量、每次脉冲处理剂量、离子质量数和化学性质等。其中，离子能量和剂量的增加有助于刻蚀样品产生微通道，但注入离子能量和剂量过高会引起靶材料遗传物质突变，适于诱变育种。因此，在植物转基因研究中，要求各种处理及培养条件尽量减小不必要的突变，所以离子束能量和剂量并不是越高越好。为此，当低能离子介导转化用至本专利技术时，本专利技术以黄芩外植体为研究对象，并在其表面进行划痕处理以及利用高浓度(400 μ g/mL)的Ri质粒进行转化以达到外源质粒的高效导入的目的，实现在提高转化效率的同时减少低能离子注入引发的宿主不必要的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种低能离子注入介导Ri质粒转化诱导黄芩毛状根的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将黄芩外植体转接到含50～200μg/mL乙酰丁香酮的MS固体培养基中，转接后于25～28℃黑暗培养2～3天，培养后用无菌水将黄芩外植体表面的培养基冲洗干净，冲洗干净后将黄芩外植体表面的无菌水用无菌风吹干，吹干后在黄芩外植体上划痕；2)经过步骤1)后，将黄芩外植体放置于离子注入机的真空靶室内，然后对黄芩外植体进行低能离子注入；3)将经过低能离子注入的黄芩外植体浸泡入含Ri质粒的TE缓冲溶液中并进行避光温育，温育的时间为2～4h，温育的温度为25～28℃，然后将黄芩外植体接种于含0.1～0.5mg/L吲哚‑3‑丁酸的MS固体培养基中，接种后于25～28℃黑暗培养21～25天诱导出毛状根。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钱卫东，王婷，付云芳，蔡长龙，毛培宏，施春阳，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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