本发明专利技术“一种罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA提取液、提取方法及其应用”，涉及植物病害的分子生物学检测技术。所述DNA提取液其组分及各组分的终浓度如下：Tris-HCl?200mM，pH?8.0；NaCl?400mM；EDTA?10mM，pH?8.0；CTAB?3％(W/V)；β-巯基乙醇4％(V/V)。该提取液作为罹病植物香蕉穿孔线虫DNA的裂解液，能够将感染植物组织的极少量的香蕉穿孔线虫的DNA完好地提取出来，而不受植物组织的酚类、蛋白酶类、解酶等物质的降解。本发明专利技术提供的DNA提取液及提取方法是采用PCR等分子生物学手段早期监测香蕉穿孔线虫感染以便于早期治理预防感染的重要基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物病害的分子生物学检测技术，特别涉及一种罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA提取液、提取方法其应用。
技术介绍
香舊穿孑L 线虫(Radopholus similis),英文俗名 the burrowing nematode ； Blackhead or toppling disease of bananas)，又叫相似穿孔线虫，它是一种极具毁灭性的外来入侵植物检疫性有害线虫，也是我国对外植物检疫对象。香蕉穿孔线虫 (Radopholus similis)为迁移性内寄生线虫，在全世界范围内的热带及亚热带均有分布 。它的寄主范围也非常广泛，已报道的寄主多达360多种，其中大多数属偶然寄主(在罹病香蕉树附近存在)和人工接种寄主。近年来，随着我国加入WT0，农产品国际贸易往来迅速发展、人员交流的日益频繁和旅游业的发展，从香蕉穿孔线虫疫区国家或地区引进各种花卉苗木及种质材料的种类和数量迅速增加，由寄主植物携带而将该线虫传入中国的可能性和传入风险日益剧增。近年来不断由我国各口岸截获香蕉穿孔线虫，事实上香蕉穿孔线虫已经逼近国门，入侵后将对我国农业生产带来毁灭性的打击和极度严重的损失。由于香蕉穿孔线虫寄主范围广，这些寄主植物在中国广泛分布。所以，如果香蕉穿孔线虫一旦从中国的温室中扩散到大田，则极易定殖和流行。这将给中国的农业生产造成严重危害。在香蕉穿孔线虫的鉴定与检测方面，往往主要以形态鉴定为主，但因为形态特征变化幅度较大及表型特征不稳定问题，传统形态鉴定往往比较困难，导致误诊。并且传统的形态坚定耗时、费力，往往需要专业人士操作，并且需要大量线虫样本，在单头线虫水平上不能达到要求。而在PCR技术上建立起来的分子鉴定方法的一系列研究进展克服了传统鉴定方法上的缺陷。目前已有许多有关利用分子和生化方法鉴定香蕉穿孔线虫的方法，如 RFLP、同工酶、RAPD, PCR等主要进行系统进化分析，揭示种间、种内差异。在植物检疫领域中，DNA分子标记是目前线虫学研究中发展较快的一种鉴定手段。线虫种特异性引物PCR扩增检测或双重PCR扩增检测是近年重要植物线虫分子诊断的重要进展之一。通过一次PCR 测验就可以在混合样品中特异性地检测出一个或多个线虫种。基于核糖体DNA(rDNA)而构建的线虫特异性引物进展较快，在诊断根腐线虫、 根结线虫中取得了突破性进展，形成了特异性诊断4种重要根腐线虫如穿刺根腐线虫 P. penetrans、斯克里布根腐线虫P. scribneri、咖啡根腐线虫P. Coffeae和卢赛根腐线虫P. Ioosi的特异性引物，以及3种根结线虫如戚乌得根结线虫M. Chitwoodi、法拉克斯根结线虫 M. fallax 和北方根结线虫 M. Hapla(Zijlstra，C. 1997，Petersen et al.，1997，Williamson et al. , 1997)的特异性引物，诊断的水平达到单条幼虫的水平。 Mulholland et al. (1996)分别构建了马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的特异性引物，描述了一种基于rDNA-ITS区域特异性等位多重PCR技术检测这两种线虫的方法，能快速鉴定马铃薯白线虫和马铃薯金线虫及其复合种群。与标准的PCR途径不同，这一技术在每个PCR反应中应用了 3个引物，通用引物5. SSrRNA、马铃薯金线虫的特异性引物ITSl-Gr 和马铃薯白线虫的特异性引物ITSl-Gp。Bulman & Marshall (1997)成功应用多重PCR技术快速诊断马铃薯孢囊线虫。在研究了秘鲁和澳大利亚的马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的 rDNA-ITS的序列结构基础上，构建了马铃薯金线虫的特异性引物PITSrf和白线虫的特异性引物PITSp4，通用引物ITS5与PITSrf可以扩增343bp马铃薯金线虫的特异性片段，与 PITSp4可以扩增出265bp特异性识别马铃薯白线虫的DNA片段。在一个PCR反应中，使用 PITSr3，PITSp4和ITS5这3个引物，即使复合种群中金线虫DNA的含量仅为白线虫的百分之一，也能从复合种群检测出金线虫。欧师琪彭德良(0u SQ, Peng DL, 2008)设计构建了大豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物SCNFI和SCNRI，专利技术了大豆孢囊线虫的一步双重PCR检测方法，检测的特异性片段长度为494bp，建立快速准确检测和早期诊断大豆孢囊线虫的分子生物学方法和技术规程， 可以检测大豆孢囊线虫单个孢囊、单头二龄幼虫和雄虫，该项检测技术获得国家专利技术专利 (ZL200510012246. 1).Subbotin, Peng DL(彭德良2001)等构建了基于rDNA-ITS区域上的大豆孢囊线虫特异性引物GlyFl，应用两组引物D3A和D3B及大豆孢囊线虫种特异性引物GlyFl和引物rDNA2成功地对大豆孢囊线虫进行了分子诊断研究。第一对引物D3A和D3B是证实PCR 扩增的成功性，第二对引物GlyFI和rDNA2是特异性检测大豆孢囊线虫。用这两对引物进行的双倍PCR扩增，从所有52个大豆孢囊线虫群体都扩大豆孢囊线虫的特异性DNA片段 (ISlbp)，而在所有测试的其他8种孢囊线虫22群体没有ISlbp片段。大豆孢囊线虫种特异性引物GlyFl灵敏性非常高，能从单条幼虫的微量DNA中扩增出大豆孢囊线虫种特异性片段。宛飞彭德良等(2008)根据马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS区的序列特征，对我国甘薯茎线虫两个不同型群体各设计了一对特异性引物。A型甘薯茎线虫特异引物为DDSl/ DDS2，特异扩增片段为252bp ；B型甘薯茎线虫特异引物为DDL1/DDL2，特异扩增片段为 485bp ；引入线虫通用引物D3A/D3B作内标，研究出一步双重PCR特异性检测甘薯茎线虫不同类型群体的分子技术和方法，该分子检测技术具有特异性强、方法可靠、灵敏性高、操作简便，检测的精确度达到单条线虫的水平。Amiri,Subbotin 等(2002)构建了基于 rDNA-ITS 的甜菜孢囊线虫(H. schachtii) 特异性引物SHF6。将特异性引物SHF6与通用引物AB28引物结合，同时将通用引物D2A和 D3B放在一个PCR反应体系中，从58个孢囊线虫群体中成功地鉴定出甜菜孢囊线虫，从36 个甜菜孢囊线虫群体中扩增200bp特异性片段，而非甜菜孢囊线虫(H. schachtiDDNA的样品没有目的片段。而基于基因组DNA的SCAR标记方面，Fullanodo, A. et. al. (1999)用随机引物 0PG5分别扩增出区分马铃薯金线虫特异性RAPD标记片段为826bp，马铃薯白线虫特异性 RAPD标记片段为llOObp。对扩增出的马铃薯金线虫和白线虫的RAPD标记片段进行全序列分析，将RAPD标记转化成SCAR标记，设计出马铃薯金线虫FullGrf和FullGrr以及马铃薯白线虫的SCAR特异性标记引物FulIGpf和FulIGpr，用FulIGrf和FulIGrr扩增出了 315bp 马铃薯金线虫的特异性片段，用FullGpf和FullGpr扩增出798bp的马铃薯白线虫的特异性片段。在香蕉穿孔线虫的分子检测方面也进行了相关研究。Kapla本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭德良，王琼，耿丽凤，李佳，彭焕，张东升，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。