一种野葛藤提取物ＨＰＬＣ指纹图谱的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种野葛藤提取物ＨＰＬＣ指纹图谱的构建方法，主要包括以下步骤：取野葛藤药材，用乙醇回流提取得醇提物粉末，用９５％的乙醇溶解，定容，滤过，得供试品溶液；然后进行高效液相色谱分析，Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ↑［ＴＭ］　Ｃ↓［１８］色谱柱，检测波长２５０ｎｍ，流动相为乙腈－０．５％乙酸水溶液；得到野葛藤提取物ＨＰＬＣ指纹图谱。本发明专利技术的方法精确，稳定，重现性好，操作简便，容易掌握，所得指纹图谱中各共有特征峰分离良好，易于辨认，能较严格地评价和控制野葛藤提取物的内在质量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，属于中药材的鉴别方 法

技术介绍
葛根作为临床常用中药，用量很大，但每年大量采挖，造成水土流失、植被 破坏等严重的环保问题，有必要寻找新的药用资源作为替代品。野葛藤为豆科植 物野葛Pueraria /obata (Willdenow) ohwi的地上干燥藤茎，与常用中药葛根同源。 在对野葛藤药用资源的开发研究中发现，野葛藤中也含有大量与葛根相同的异黄 酮成分，有可以替代葛根入药的可能性。但野葛藤药材因品种、产地的不同，其 有效成分的含量存在一定的差异，因此用于临床的质量稳定性也难以保证。目前， 还没有建立一种能较好的控制其质量的方法。中药指纹图谱是指采用一定的分析手段得到的某种中药材或中药制剂中所 共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱图或光谱图。以指纹图谱作为中药 (天然药物)提取物及其制剂的质量控制方法，已成为目前国际共识，美国食品 药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料中提供色谱指纹图谱；世界卫生组 织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定，如果草药的活性成分不明确， 可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致；欧共体在草药质量指南中亦称， 单靠测定某种有效成分考查质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体 为活性物质。因此，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含 化学成分的种类与数量，是现阶段控制中药内在质量的有效手段。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，为确保野葛藤提取物的质量，控制和评价其质量稳定性提供依据。 本专利技术是通过以下技术方案实现的所述的野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤(1) 供试品溶液的制备称取野葛藤药材，每50g加入65%~75% (V/V)的乙醇300~350mL，回流提取3次， 每次l 2h，合并提取液，回收乙醇，浓縮至比重1.12后离心，取上清液上大孔树脂 柱，依次用2倍柱体积的纯化水、5倍柱体积的70。/。(V/V)乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液， 回收乙醇，浓縮，喷雾干燥，干燥成细粉；取上述细粉约5mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加95。/。(V/V)的乙醇10ml溶解， 加重蒸水定容至刻度，用微孔滤膜滤过，所得续滤液即为供试品溶液；(2) 高效液相色谱分析色谱条件色谱柱DiamonsilTMd8色谱柱，250mmX4.6mm， 5pm;检测波长250nm，流动相流速1.0ml/min，柱温为室温，进样量为lOpl;流动相A 为乙腈，流动相B0.5。/。(V/V)的乙酸水溶液，采用梯度洗脱，洗脱程序如下其中下述 比例为体积比Omin时，流动相A:流动相B45:85; 40min时，流动相A:流动相B-40 : 60; 60min时，流动相A:流动相B-50 : 50;(3)精确吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按上述条件操作，得到野葛藤提取物的 HPLC指纹图谱。该指纹图谱所具有的共有特征峰为(4)、 (7)、 (12)、 (16)四个峰，其保留时间分别 为7.9min、 12.8min、 19.7min、 31.2min，经分析确定这四个峰依次为葛根素、大豆苷、 染料木苷和大豆苷元的特征峰。进一步的，本专利技术方法中得到的指纹图谱的共有特征峰还包括(l)、 (2)、 (3)、 (5)、 (6)、 (8)、 (9)、 (10)、 (11)、 (13)、 (14)、 (15)、 (17)十三个峰，其保留时间分别为5.2min、 6.1min、 6.9min、 8.9min、 10.7min、 14.1min、 14.9min、 16.7min、 18.1min、 20.9min、524.3min、 27.7min、 32.5min。按照本专利技术所述的方法，在供试品溶液的制备时，优选每50g野葛藤样品加 入70%的乙醇300mL，进行回流提取，每次提取1.5h。 所述的大孔树脂柱优选为HPD100或HPD600型。为保证野葛藤药材的质量稳定性，确定野葛藤药材的定期采集时间为每年l-4 和9-12月。本专利技术选取不同产地、不同采集时间的药材20多批，按本专利技术的方法进行 高效液相分析，通过对不同批次图谱的比较，确定了其共有的特征峰。本专利技术的有益效果是通过大量的实验研究，明确了野葛藤药材的采集时间、 提取方法，并对野葛藤醇提物的纯化工艺和HPLC色谱条件进行了优化选择，最 终通过高效液相色谱法确定了野葛藤提取物指纹图谱的总体特征；该方法精确， 稳定，重现性好，操作简便，容易掌握，所得指纹图谱中各共有特征峰分离良好，易 于辨认，能较严格地评价和控制野葛藤提取物的内在质量。 附图说明图1为按本专利技术方法获得的野葛藤提取物的HPLC指纹图谱。 图2为按实施例1方法获得的混合对照品和野葛藤提取物的指纹图谱。 其中，1~17为野葛藤提取物的HPLC指纹图谱中的共有特征峰。 A F为不同批次的野葛藤提取物的HPLC指纹图谱。G为混合对照品的图谱，峰l:葛根素；峰2:大豆苷；峰3:染料木苷；峰 4:大豆苷元。具体实施方式 实施例1 1仪器Waters高效液相色谱仪Empower色谱工作站，Waters600泵，Waters2996检测器； AE-241型分析天平上海梅特勒-托利多仪器有限公司。试剂95%乙醇(分析纯)天津 市北方天医化学试剂厂20050314;甲醇(色谱纯)天津市科密欧化学试剂开发中心20060427;冰醋酸(优级醇)天津市科密欧化学试剂开发中心20051015。对照品葛根素(中国药品生物制品检定所，编号110752-200209);大豆苷(中国药品生物制品检定所，编号111738-200501)，染料木苷(中国药品生物制品检定所，编号111709-200501)，大豆苷元(中国药品生物制品检定所，编号1502-200101)，染料木素(中国药品生物制品检定所，编号111704-200501)。2试药野葛藤药材共6批，编号1 6号。l号山东新泰，采集时间2004.02; 2号河南西峡，采集时间2004.11;3号济南柳埠，采集时间2006.11; 4号济南西营釆集时间2006.11;5号山东烟台，采集时间2006.11; 6号济南彩石，采集时间2006.11。将上述采集到的药材切成薄片晒干。取野葛藤切片，每50g加入70X (V/V)的 乙醇加热回流提取，提取3次，每次1.5h，合并提取液，回收乙醇浓缩至适量，离心， 取上清液加于已处理好的HPD100型大孔吸附树脂柱上，然后依次用2BV的纯化水和 5BV的70X (V/V)的乙醇洗脱，收集相应的洗脱液，回收乙醇后，喷雾干燥，进口 温度12(TC，出口温度65。C，即得野葛藤醇提物粉末。 3方法与结果 3.1供试溶液制备3丄1对照品溶液制备精密称取对照品葛根素1.20mg，大豆苷1.30mg，染料木苷0.57mg，大豆苷元0.97mg，染料木素0.5mg，置同一容量瓶中，加95%乙醇溶解至10ml，摇匀，用微孔滤膜(孔径微0.45pm)滤过，滤液作为对照品混合溶液。3丄2供试品溶液的制备:取1-6号野葛藤提取物粉末各约5mg，分别精密称定，置25ml容量瓶中，加95% 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种野葛藤提取物ＨＰＬＣ指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：　（１）供试品溶液的制备：　称取野葛藤药材，每５０ｇ加入６５％～７５％（Ｖ／Ｖ）的乙醇３００～３５０ｍＬ，回流提取３次，每次１～２ｈ，合并提取液，回收乙醇，浓缩至比重１．１２后离心，取上清液上大孔树脂柱，依次用２倍柱体积的纯化水、５倍柱体积的７０％（Ｖ／Ｖ）乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，喷雾干燥，干燥成细粉；　取上述细粉约５ｍｇ，精密称定，置２５ｍｌ容量瓶中，加９５％（Ｖ／Ｖ）的乙醇１０ｍｌ溶解，加重蒸水定容至刻度，用微孔滤膜滤过，所得续滤液即为供试品溶液；　（２）高效液相色谱分析：　色谱条件：ＤｉａｍｏｎｓｉｌＴＭ　Ｃ１８色谱柱，２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ；　检测波长２５０ｎｍ，流动相流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ，柱温为室温，进样量为１０μｌ；流动相Ａ为乙腈，流动相Ｂ　０．５％（Ｖ／Ｖ）的乙酸水溶液，采用梯度洗脱，洗脱程序如下：其中下述比例为体积比：　０ｍｉｎ时，流动相Ａ：流动相Ｂ＝１５∶８５；　４０ｍｉｎ时，流动相Ａ：流动相Ｂ＝４０∶６０；　６０ｍｉｎ时，流动相Ａ：流动相Ｂ＝５０∶５０；　（３）精确吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按上述条件操作，得到野葛藤提取物的ＨＰＬＣ指纹图谱。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李贵海，刘逢芹，于希昌，刘田云，
申请(专利权)人：山东省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]