采用惰性多孔载体的纤维素酶固态发酵方法技术

本发明专利技术公开了属于工业发酵技术领域的一种采用惰性多孔载体的纤维素酶固态发酵方法。以固体培体养基为发酵基质，加入聚氨酯泡沫等惰性多孔载体可显著提高纤维素酶的生产强度，吸附在惰性基质上的菌体可以用于半连续发酵，发酵残基可全部用于产品的提取；以吸附在惰性载体上的液体培养基为发酵基质时，纤维素酶的半连续发酵更易于进行，同时该体系的抗剪切能力也显著增强，从而使纤维素酶的固态发酵不仅仅局限在浅盘反应器内进行。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于工业发酵
，特别涉及一种采用惰性多孔载体的纤维素酶 固态发酵方法。
技术介绍
固态发酵是指在固态、半固态或富含营养物质的惰性载体上培养微生物的方 法。与液态发酵相比，固态发酵过程三废排放少，环境污染较小，能耗较低， 设备投资小，产品的后处理过程一般比较简单，许多产品可以直接烘干而无需提 取，产品易于忙藏、运输，而且稳定性好。然而，由于传统的固态发酵中传质、 传热效率低等问题在工业化规模生产中一直未得到很好的解决，这在很大程度上 制约了固态发酵技术的发展。为改善固态发酵过程，本专利技术将多孔惰性载体应用于纤维素酶的固态发酵 中，由于惰性载体具有较大的比表面并且能在发酵过程保持其结构，不但有效地 改善了发酵基质中的传质和传热，从而显著提高了纤维素酶的生产强度，而且吸 附在惰性载体上的菌体还可用于半连续发酵。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，其特 征在于，该方法以惰性多孔材料为载体，包括1)以固态培养基为发酵基质，在发酵基质中加入惰性多孔载体，固态基质 与惰性多孔载体的质量比为(10-120): 1，接入相对于发酵基质的种子液质量的5-30%的纤维素酶产生菌，并以发酵过程中吸附在惰性多孔载体上的菌体为菌种，通过添加灭菌后的新鲜发酵基质继续发酵以实现半连续化生产，而发酵残基全部用于发酵产品的提取；2)以液体培养基为发酵基质，将其吸附在惰性多孔载体上，接入相对于发 酵基质的种子液质量5-30%的纤维素酶产生菌，耦合发酵与浸提过程，并以浸提 后吸附在惰性多孔载体上的菌体为菌种，通过添加灭菌后的新鲜液体发酵基质继续发酵以实现半连续化生产纤维素酶。所述惰性多孔载体材料为聚氨酯泡沫、聚氯乙烯泡沫或聚苯乙烯泡沫。所述纤维素酶产生菌为绿色木霉(7V/c力oc/e7vz7s)、青霉(尸e/7j'L 鹏)、曲 霉(^■per^iWM,黑曲霉)或根霉(朋h叩〃s)。本专利技术的有益效果为(1).以固态培养基为发酵基质时，惰性载体明显改 善了发酵过程中的传质和传热，使生产强度显著提高。利用吸附在惰性载体上的 菌体进行半连续发酵，发酵残基全部用于产品的提取，可使产品的损失比一般需要浸提的半连续过程少。(2).以液体培养基为发酵基质时，该体系的抗剪切能力大大增强，从而使纤维素酶的固态发酵不仅仅局限在浅盘反应器内进行。 具体实施例方式以固态培养基为发酵基质的发酵 实施例1按无菌操作将发酵基质接入30% (指相对于发酵基质的种子液质量百分比) 绿色木霉(TrichodermaSR3.2942)菌种，发酵基质组成为4%NaOH溶液40°C 下浸泡24小时的碱处理稻壳、麸皮和无机盐水溶液(按质量百分比浓度包括1% (NH4) 2S04、 0.3%KH2PO4、 0.5。/。MgS04和0.5%CaCL2)，稻壳与麸皮的质量比 为3: 7，发酵基质与无机盐水溶液的质量比为1:1;把已灭菌的惰性多孔载体 加入发酵基质中，混合均匀，惰性多孔载体与发酵基质的质量比例为1: 24; pH 自然，培养温度3(TC。结果表明，加入惰性多孔载体的发酵体系每克底物所产纤 维素酶酶活(滤纸酶活)比不加惰性载体的发酵体系纤维素酶酶活提高了 70.6%;加入惰性多孔载体的发酵体系所产纤维素酶酶活(滤纸酶活)最高值出现在料层厚度为4.5cra时，而不加入惰性多孔载体的发酵体系所产纤维素酶酶活(滤纸酶 活)最高值出现在料层厚度为3.0cm时，加入惰性多孔载体的发酵体系每克底物 所产纤维素酶酶活(滤纸酶活)最高值比不加惰性载体的发酵体系纤维素酶酶活 最高值提高了20.4%，对于相同的反应器，把惰性载体所占的体积考虑在内，加 入惰性多孔载体的发酵体系每体积底物所产纤维素酶酶活(滤纸酶活)比不加惰 性载体的发酵体系纤维素酶酶活仍提高了 12.8%。4实施例2依实施例1的步骤，发酵培养96小时，此时发酵基质中纤维素酶活性接近最 高，于无菌环境下，把固定化细胞的惰性多孔载体从发酵基质中分离出来，加入 新鲜的己灭菌的培养基中继续发酵，新鲜培养基与第一次发酵基质的质量比为1: 1。实验结果表明，第二次、第三次发酵的最高滤纸酶活分别为第一次批式发酵最高滤纸酶活的86.6%和47.7%，比不加入惰性多孔载体的发酵体系所产滤纸酶 活分别提高了40.6%和4%;第二次、第三次发酵的最高CMCase酶活分别为第一 次批式发酵最高CMCase酶活的92.9%和113.9%。 实施例3按无菌操作将发酵基质接入30% (指相对于发酵基质的种子液质量百分比) 绿色木霉(Trichoderma SP.3.2942)菌种，发酵基质组成为微晶纤维素、麸皮 和无机盐水溶液(按质量百分比浓度包括1% (NH4) 2S04、 0.3%KH2PO4、 0.5%MgSOjn0.5%CaCL2，)，微晶纤维素与麸皮的质量比为3: 7，发酵基质与无 机盐水溶液的质量比为l: 1;把以灭菌的惰性多孔载体加入发酵基质中，混合均 匀，惰性多孔载体与发酵基质的比例为1: 24; PH自然，培养温度3(A:;于发 酵培养96小时时，发酵基质中纤维素酶活性接近最高，于无菌环境下，把固定 化细胞的惰性多孔载体从发酵基质中分离出来，加入新鲜的已灭菌的培养基中继 续发酵，新鲜培养基与第一次发酵基质的质量比为1: 1。实验结果表明，第二次、 第三次发酵的最高滤纸酶活分别为第一次批式发酵最高滤纸酶活的85.2%和 60.8%;第二次、第三次发酵的最高CMCase酶活分别为第一次批式发酵最高 CMCase酶活的151.1%和86.0%。以液体固态培养基为发酵基质的发酵-实施例4:绿色木霉采用惰性多孔载体半连续发酵一浸提耦合法固态发酵生产 纤维素酶，具体步骤如下(1)在500ml烧瓶中加入2g聚氨酯泡沫惰性多孔载体，灭菌后接入30%(指 相对于聚氨酯泡沫的饱和吸附量百分比)绿色木霉(Trichoderma SP.3.2942)种子液。5(2) 配制营养液在100ml的10%麸皮汁(20g麸皮在200ml去离子水中煮 15分钟过滤而得)中加入4g葡萄糖、2g硫酸氨、0.5g吐温40、 O.lg硫酸钠以及 lgCMC。将营养液加到己接种载体上，在载体达到饱和吸附量后继续添加直至烧瓶中游离 的营养液达到100ml，然后将其放在转速为130r/min的摇床上在30'C下进行发酵。(3) 当发酵进行到第三天的时候(酶活达到最大)将游离的营养液取出，用 0.01mol/L的醋酸缓冲液(PH4.8) 200ml分两次浸提载体，浸提完后将载体放回 烧瓶中加入100ml的营养液后继续发酵。(4) 然后每三天一个批次重复操作4，直至发酵结束。发酵过程中所产纤维素酶大部分随营养液的更换而被取出，还有一部分通过 浸提载体获得。该固态发酵方法可进行5个批次，将一次接种后的可生产周期从 6天延长到了 17天，与相同条件的批式发酵相比，采用该方法纤维素酶的滤纸酶 活的生产强度(平均每天获得的滤纸酶活)提高了 54.5%。实施例5:黑曲霉采用惰性多孔载体半连续发酵一浸提耦合法固态发酵生产 纤维素酶，具体步骤与实施例1相同，只是将发酵菌种换成黑曲霉。在本实验中，发 酵也进行了5个批次，与相同条件的批式发酵相比，滤纸酶活的生产强度提高了 57.4%。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用惰性多孔载体的纤维素酶固态发酵方法，其特征在于，该方法以惰性多孔材料为载体，包括：　１）以固态培养基为发酵基质，在发酵基质中加入惰性多孔载体，固态基质与惰性多孔载体的质量比为（１０－１２０）∶１，接入相对于发酵基质的种子液质量 的５－３０％的纤维素酶产生菌，并以发酵过程中吸附在惰性多孔载体上的菌体为菌种，通过添加灭菌后的新鲜发酵基质继续发酵以实现半连续化生产，而发酵残基全部用于发酵产品的提取；　２）以液体培养基为发酵基质，将其吸附在惰性多孔载体上，接入相对于 发酵基质的种子液质量５－３０％的纤维素酶产生菌，耦合发酵与浸提过程，并以浸提后吸附在惰性多孔载体上的菌体为菌种，通过添加灭菌后的新鲜液体发酵基质继续发酵以实现半连续化生产纤维素酶。

【技术特征摘要】
1.一种采用惰性多孔载体的纤维素酶固态发酵方法，其特征在于，该方法以惰性多孔材料为载体，包括1)以固态培养基为发酵基质，在发酵基质中加入惰性多孔载体，固态基质与惰性多孔载体的质量比为(10-120)∶1，接入相对于发酵基质的种子液质量的5-30％的纤维素酶产生菌，并以发酵过程中吸附在惰性多孔载体上的菌体为菌种，通过添加灭菌后的新鲜发酵基质继续发酵以实现半连续化生产，而发酵残基全部用于发酵产品的提取；2)以液体培养基为发酵基质，将其吸附在惰性多孔载体上，接入相对于发酵基质的种子液质量5-30％的纤维...

【专利技术属性】
技术研发人员：周玉杰，张建安，胡铁刚，刘建国，程可可，刘宏娟，刘德华，戴玲妹，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]