共价结合的寡核苷酸和小沟结合剂的轭合物制造技术

小沟结合剂与寡核苷酸通过共价键结合，寡核苷酸的碱基序列与单链或双链ＤＮＡ、ＲＮＡ或杂合体的靶序列互补。共价结合的寡核苷酸－小沟结合剂共轭物能增强与互补链靶序列的结合力。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
共价结合的寡核苷酸和小沟结合剂的轭合物1.专利
本专利技术涉及新的寡核苷酸衍生物。具体地讲，本专利技术涉及一个或多个小沟结合 剂与寡核苷酸共价结合的寡核苷酸衍生物。这种寡核苷酸-小沟结合剂共轭物(以后称 0DN-MGB)有较强的杂交能力，与单链或双链核酸的互补序列的结合力也较强。因此可用作 序列特异的探针，并作为反义核酸和反义基因(anti-gene)治疗药物。2.现有技术的简述与双链DNA的小沟通过非共价键结合的小沟结合剂在本领域是已知的。能与双链 DNA或RNA以非共价键结合的嵌入剂也是熟知的。这些嵌入剂一般属于平面芳香族化合物， 它们嵌入(置身于)双链DNA或RNA的嘌呤和嘧啶碱基对之间。美国专利US 4835263描 述了一种与嵌入基共价结合的寡核苷酸。这种携带有嵌入基的寡核苷酸可用作杂交探针。本专利技术概述本专利技术涉及寡核苷酸与小沟结合基共价结合的结合物。该结合物包括具有多个核 苷酸单位、一个3'端、一个5'端的寡核苷酸和与至少一个所述的核苷酸共价结合的小沟 结合基。小沟结合剂一般通过一条含有不超过15个原子的链即连接基与寡核苷酸相结合。 小沟结合基是分子量为约150-2000道尔顿的分子基团，与双链DNA、RNA或杂合体的小沟以 非嵌入方式连接，其缔合常数大于IO3MA另一方面，本专利技术还涉及某些共价结合的寡核苷酸_小沟结合剂结合物的合成方 法，以及该结合物用作核酸探针的方式及为有关分析和诊断以及治疗目的(作为反义核酸 和反义基因)用的方式。附图的简要描述附图说明图1所示的是修饰的ODN或3’-0DN-CDPI3轭合物与M13mpl9 (+)链DNA的狭缝印 迹杂交分析的结果。下划线核苷酸表示与质粒靶序列错误配对的碱基。本专利技术的详细描述总的实施方案本专利技术新结合物的显著特征是小沟结合剂与寡核苷酸共价结合，本专利申请的引 言部分已经指出小沟结合剂是结合在双链DNA的小沟内的分子。但由于这类化合物的结构 变化大，不能用一般通式来表示所有已知小沟结合剂的化学结构。能与DNA小沟结合的化 合物一般都有月牙形的三维结构。现有技术中的大多数小沟结合剂都优先与B型双链DNA 的A-T富含区结合。小沟结合剂或更准确地说本专利技术寡核苷酸_小沟结合剂轭合物的基团 当然也优先与双链DNA的A-T富含区结合(本专利技术的寡核苷酸_小沟结合剂轭合物在下文 中存时也称为0DN-MGB)。然而，优先与C-G (胞嘧啶和鸟嘌呤)富含区结合的在理论上也是 可能存在的。因此含有这样的优先与C-G富含区结合的小沟结合基的ODN-MBG亦属本专利技术 的范畴。已有的小沟结合剂优先与A-T区结合，可解释为鸟嘌呤(G)的2-位氨基与某些已 知的小沟结合剂之间存在立体位阻。从下文的详述中可明显看出，在本专利技术的ODN-MBG中 鸟嘌呤(G)被6-羟基嘌呤取代后，上述不利的立体位阻不复存在，ODN-MGB与互补链的结 合力可能增强。4一般地讲，现有技术中已知的小沟结合剂一般不与双链RNA或DNA和RNA的双链 杂合体结合。然而本专利技术的ODN-MGB却能够与单链RNA结合，上述性质是本专利技术的另一有 趣的新方面。根据本专利技术，能与ODN共价结合形成ODN-MGB轭合物的现有的小沟结合剂是一些 天然产物如纺锤菌素、偏端霉素和lexitropsin、光辉霉素、色霉素A3、橄榄霉素、氨菌霉 素、西伯利亚霉素和有关抗生素与合成衍生物。另一些双季铵杂环化合物、二芳基脒如戊烷 脒、芪脒和berenil、cc-1065与有的吡咯并吲哚和吲哚多肽、Hoechst 33258,4' -6- 二脒 基-2-苯基吲哚(DAPI)及许多由天然氨基酸或合成氨基酸构成的寡肽也是小沟结合剂。下 列化合物的结构如下^h 3Netropsin^CONH,H η/^=^ a “ Α Γ^==^ ^Pertamidire5 就本专利技术目的而言，如果一个分子能与双链DNA的小沟结合，其间的缔合常数为 IO3M-1或更高，则该化合物就是小沟结合剂。这种结合可通过现有的光谱分析法如紫外光谱 (U. V.)、核磁共振光谱(nmr)进行检测，还可利用凝胶电泳法。紫外光谱在有小沟结合剂连 接时吸收峰移动，以及利用“奥佛赫塞”(NOSEY)效应的核磁共振光谱均是实现此目的有用 技术。凝胶电泳则检测小沟结合剂与双链DNA或其片段的结合，因为该结合使双链DNA的 迁移率发生了变化。嵌入分子或嵌入剂易于与小沟结合剂区别开，嵌入剂为平面芳香族(优选多环) 分子，而小沟结合剂(MGB)则为月牙形或类似几何结构的分子。此外二者还可通过核磁共 振光谱(nmr)中的“奥佛赫塞”(NOSEY)效应进行实验区别。如上所述，就本专利技术目的而言，如果一个分子与双链DNA的小沟相结合的缔合常 数等于或大于Ι ΛΓ1，则该分子就是小沟结合剂。然而，某些小沟结合剂与双链DNA的高亲 和部位相结合，缔合常数可高达IO7-IiAr1。根据本专利技术，小沟结合剂经修饰则本质上成为小沟结合基，与适当的共价结构或原子链连接，小沟结合剂通过所述共价结构或原子链与寡核苷酸(ODN)相连。在某种 意义上这种原子链可作为并有时被认为是小沟结合剂的一部分，因为这种连接并不影响 ODN-MGB分子的小沟结合性能。然而，从概念上将小沟结合剂与将它与ODN共价连接的基 团区别开更适于本专利技术的描述。这个由小沟结合剂衍生形成的基团在下文称为“小沟结合 基”。而连接小沟结合基与ODN的共价结构(不超过15个原子)则称为“连接基”。这里先 描述本专利技术的ODN-MGB轭合物的寡核苷酸部分，然后再详细描述根据本专利技术的小沟结合基 的优选实施方案。从广义上讲，本专利技术的ODN-MGB轭合物的寡核苷酸含有约3_100个核苷酸单位。 根据本专利技术，这些可形成ODN的核苷酸单位包括天然核酸中存在的主要杂环碱基(U、C、 T、A、G)、这些碱基的天然与化学修饰物和这些碱基的类似物如6-羟基嘌呤、2-氨基腺嘌 呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-N4亚乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶 和6-氨基-4-羟基-[3，4-d]嘧啶。5-N4亚乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡唑并[3，嘧啶和 6_氨基-4-羟基[3，4-d]嘧啶的2-脱氧核苷的各自结构如下 2-脱氧5-N4-亚乙烯基胞苷2-脱氧4_氨基吡唑并[3，4_d]嘧啶核苷 2-脱氧6-氨基-4-羟基吡唑_[3，4-d]嘧啶核苷R = 2-脱氧-β -D-呋喃糖基此外，掺入本专利技术ODN-MGB轭合物中的ODN中的核苷酸单位可以具有交联官能团 (烷化剂)，它通过连接臂与一个或多个碱基共价结合。因这类结合有交联剂的ODN-MGB轭 合物构成了本专利技术优选实施方案中的重要一类，在下文下面将对这些结构进行更详细的描 述。本专利技术ODN-MGB中的糖基或糖苷部分可以是脱氧核糖、核糖、2-氟核糖、2-0-烷 基或链烯基核糖，其中所述的烷基可有1-6个碳原子，链烯基可有2-6个碳原子。在天然 核苷酸及本文所述的修饰物和其类似物中，脱氧核糖和核糖部分形成呋喃糖环，糖苷键为 β-构型，且嘌呤碱基通过9-位、嘧啶通过1-位以及吡唑并嘧啶通过1-位分别与糖环相 连。根据本专利技术，寡脱氧核糖核酸为优选的，因此2-脱氧核糖为优选的糖。ODN的核苷酸 单位通过磷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有如下通式的化合物：　　＊＊＊　　其中　　Ｒ是ＣＯＮＨ↓［２］或ｔ－丁基氧－羰基，并且Ｒ↓［１］是２，３，５，６－四氟苯氧基。

【技术特征摘要】
US 1995-4-3 08/415,370一种具有如下通式的化合物其中R是CONH2或t 丁基氧 羰基，并且R1是2，3，5，6 四氟苯氧基。F2009101732576C00011.tif2.根据权利要求1的化合物，其中R是CONH2。3.根据权利要求1的化合物，其中R是t-丁基氧-羰基。4.一种具有如下通式的化合物其中 R是CONH2或t- 丁基氧-羰基，并且R1是2，3，5，6-四氟苯氧基。5.根据权利要求4的化合物，其中R是CONH2。6.根据权利要求4的化合物，其中R是t-丁基氧-羰基。7.一种具有如下通式的化合物 其中队是2，3，5，6_四氟苯氧基。8. 一种具有如下通式的化合物 其中CPG表示一...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊戈尔V库佳温，欧亨尼A卢克坦诺夫，霍华德B冈佩尔，小里奇B迈耶，
申请(专利权)人：埃利泰克控股有限公司，
类型：发明
国别省市：US