紫杉醇及多西紫杉醇的用途制造技术

本发明专利技术公开了紫杉醇作为疫苗佐剂的应用，还公开了多西紫杉醇作为疫苗佐剂的应用。疫苗为蛋白质疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或全病毒疫苗。本发明专利技术充分运用了紫杉醇和多西紫杉醇能够激活天然免疫系统的原理，以紫杉醇和多西紫杉醇作为疫苗佐剂应用于疫苗的制备，可以大幅度提高疫苗诱导的细胞和体液免疫反应强度，减少注射部位的局部刺激反应，且可以冰冻保存疫苗，延长疫苗贮存期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及紫杉醇及其多西紫杉醇用于制备疫苗的佐剂用途。
技术介绍
疫苗是控制人类和动物传染病的重要手段。 一个理想的疫苗用于免疫接种后，不仅可以在被免疫的个体中产生足够的免疫反应强度，而且可以产生适宜的免疫反应类型，发挥免疫保护作用。在疫苗生产阶段，通常采用增加抗原用量或在疫苗中加入佐剂的方法来保障疫苗的有效性。增加抗原的用量使疫苗的生产成本提高，以及潜在着增加抗原依赖性毒副作用的缺点。纯化抗原可以减少疫苗的毒副作用，但这又使生产疫苗的成本增加。在疫苗中加入佐剂可以在保障疫苗有效性的同时，减少抗原的用量，减少生产抗原所需的成本，并可在免疫注射时降低抗原依赖性毒副作用的产生，如注射局部红肿、疼痛，头晕等。如果所用的佐剂足够安全，则疫苗中加了佐剂后，在保障疫苗有效性的同时，既可降低疫苗的生产成本，又可提高疫苗的安全性。具有佐剂作用的物质虽然很多，但迄今被美国食品和药物管理局(FDA)准许的人用疫苗中，氢氧化铝是唯一的一种佐剂。铝佐剂在疫苗中吸附抗原而形成复合物，注射后在局部形成抗原贮存库，缓慢释放出抗原发挥佐剂作用。铝佐剂主要促进体液免疫应答，适用于以抗体为保护性免疫的疾病疫苗，如白喉、破伤风、乙肝、麻疹等。铝佐剂虽然在人用或兽用疫苗上广泛应用，仍存在许多缺点，如轻度局部反应，形成肉芽肿，甚至发生局部无菌性脓肿；人的一种肌肉的局部组织损伤可能和铝佐剂有关；此外，铝胶冷冻后胶体状态被破坏，不能发挥佐剂作用，因此不能冷冻保存；不同制备批次的铝胶佐剂，胶体状态不同，难以获得相同佐剂效果。 综上所述，现有的铝胶佐剂存在着以下缺陷 1)现有的铝胶佐剂主要促进体液免疫反应，而对细胞免疫反应的效果弱； 2)现有的铝胶佐剂引起的注射部位局部剌激反应大； 3)现有的铝胶佐剂疫苗不能冰冻保存，贮存期短。 1963年美国化学家瓦尼(M.C.Wani)和沃尔(Monre E.Wall)首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉(Pacific Yew)树皮和木材中获得紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高的抑制作用，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克(Duke)大学的化学教授姆克法尔(Andre T.McPhail)合作，通过X-射线分析确定了该活性成份的化学结构是一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇(taxol)。纯品紫杉醇呈白色结晶性粉末状，相对分子质量为853. 9，熔点为213 216t:，无臭，无味，化学结构式如图1所示。由于其天然含量极低，在当时未引起人们的注意。1977年，Horwitz博士发现其抗癌机理是能够与癌细胞的微管蛋白结合，促进微管蛋白聚合装配成微管二聚体，从而抑制微管的正常生理解聚，使细胞有丝分裂停止在G2期及M期，阻止了癌细胞的快速繁殖。紫杉醇抗癌机理的发现推动了它在临床方面的研究。已有报道，紫杉醇可有效治疗卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、食管癌、精原细胞瘤和何金氏淋巴瘤等。目前，紫杉醇制剂已被美国FDA批准作3为抗癌新药在临床应用，在我国临床上也广泛用于癌症治疗。最近的研究发现，紫杉醇有具有脂多糖(LPS)样作用，能够激活天然免疫系统，上调一些细胞因子和相关基因的表达。多西紫杉醇(docetaxel)是在紫杉醇的基础上人工合成的，在C4和C5位置上含有一个带有氧四环的紫杉烷环结构，并在C13位置上含有一个庞大的酯侧链，化学结构式如图2所示。纯品多西紫杉醇为白色粉末，相对分子质量为807. 88，熔点为232°C 。 虽然发现紫杉醇和多西紫杉醇的抗癌作用迄今已有40多年，但将上述2者作为疫苗佐剂的使用尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种紫杉醇以及多西紫杉醇的新用途能作为疫苗佐剂。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供紫杉醇作为疫苗佐剂的应用。 本专利技术还同时提供了多西紫杉醇作为疫苗佐剂的应用。 上述疫苗为蛋白质疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或全病毒疫苗。 本专利技术实际应用中，是在制造疫苗的过程中加入紫杉醇或多西紫杉醇；使每毫升疫苗中含紫杉醇或其多西紫杉醇0. 1 10毫克。 本专利技术充分运用了紫杉醇和多西紫杉醇能够激活天然免疫系统的原理，以紫杉醇和多西紫杉醇作为疫苗佐剂应用于疫苗的制备，可以大幅度提高疫苗诱导的细胞和体液免疫反应强度，减少注射部位的局部剌激反应，且可以冰冻保存疫苗，延长疫苗贮存期。紫杉醇及其多西紫杉醇用于疫苗生产，方法简便，无需过多改变现有生产工艺。此外，由于紫杉醇及其多西紫杉醇已经被批准用于人医临床，用紫杉醇及其多西紫杉醇作为佐剂开发新型疫苗避免了针对佐剂进行的繁杂的安全性试验。附图说明 下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。 图1是紫杉醇的化学结构式； 图2是多西紫杉醇的化学结构式； 图3是一免后两周和二免后两周各组小鼠血清0VA特异性IgG和IgM抗体效价对比图； 图3中A代表IgG抗体效价，B代表IgM抗体效价； 图4是一免后两周和二免后两周各组小鼠血清OVA特异性IgG亚类水平(血清1 : 100稀释)； 图5是二免后两周各组小鼠脾细胞在特异性抗原0VA和有丝分裂源ConA以及LPS剌激后的增殖情况对比图； 图6是二免后两周各组小鼠脾细胞在特异性抗原0VA剌激后细胞因子IL-12,IFN- y ， IL-4和IL-10的mRNA表达情况对比图; 图7是二免后两周各组小鼠脾细胞在特异性抗原OVA剌激后T-bet/GATA3mRNA表达情况对比图； 图8是紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)对模式抗原OVA的佐剂作用。4 图9是紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)对全病毒抗原灭活口蹄疫病毒的佐剂作用。 上述图3 9中，具有a、b不同字母的组表示有统计学差异(P < 0. 05); 图10是一免后两周和二免后两周各组小鼠血清H1N1特异性IgG抗体水平对比图； 图11是冻融实验前后的IgG水平的对比图。具体实施例方式为验证本专利技术的紫杉醇及其多西紫杉醇疫苗佐剂作用，用卵清白蛋白(OVA)作为模式抗原进行动物试验。 实例1 :不同剂量的紫杉醇对小鼠注射模式抗原卵清白蛋白(OVA)的佐剂作用 —、材料和方法 1.实验动物 雌性ICR小鼠60只，购自上海实验动物中心。 2.抗原 模式抗原卵清白蛋白(OVA)购自Sigma公司。OVA通过内毒素去除柱(Pierce公司)去除两次，除去内毒素，然后用BCA试剂盒法定量(Pierce公司)。 3.紫杉醇(Taxol)购于上海和氏璧生物技术有限公司(Shanghai Tauto Biotech Co. ， Ltd.)。 4.氢氧化铝铝胶 购于浙江万马有限公司。 5.试验疫苗制备先将紫杉醇溶解在无水乙醇中(40mg/ml) ， OVA溶解在生理盐水中(0. 25mg/ml)。向一试管内加入吐温_80、无水乙醇、OVA生理盐水溶液、生理盐水、紫杉醇溶液或者氢氧化铝铝胶，每100微升的实验疫苗中所含0VA、 Taxel和铝胶的含量如表1所示。 表1、各组实验疫苗所含成分(/100 1)<table>table see original document page本文档来自技高网...

【技术保护点】
紫杉醇作为疫苗佐剂的应用。

【技术特征摘要】
紫杉醇作为疫苗佐剂的应用。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：胡松华，
申请(专利权)人：胡松华，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]