本发明专利技术涉及医药生物学技术领域。ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１５５是一种调节Ｔ细胞和Ｂ细胞成熟及天然免疫反应的小分子ＲＮＡ。本发明专利技术提供一种基于ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１５５设计的用于增强核酸疫苗细胞免疫效果的质粒，经过在ｐｃＤＮＡ－３．１质粒中插入ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１５５前体分子的表达序列获得质粒ｐｃＤＮＡ３．１－ｐｒｅ－ｍｉＲ－１５５，可高效表达ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１５５前体分子，并不影响共转染的核酸疫苗的表达能力。在体内试验中，该质粒与核酸疫苗同时注射具有有效地诱导细胞免疫反应的能力，表现为抗原特异性脾脏ＩＦＮ－γ阳性细胞增多和脾脏ＣＤ８阳性细胞杀靶能力增强。本发明专利技术的质粒可以添加到现有核酸疫苗制剂内混合注射，从而显著促进核酸疫苗诱导的细胞免疫反应，作为一种新型的细胞免疫佐剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药生物学
，尤其涉及核酸疫苗的免疫活性增强
技术介绍
MicroRNAs是一种丰富的内源性的非编码的RNAs，在转录的过程中在3' UTR区通 过缺陷碱基互补配对来调节靶向性mRNAs的表达，由此调节mRNA分裂及转录抑制。(Kato， Μ. and Slack, F. J. (2008)microRNAs:small molecules with big roles-C. elegans to human cancer. Biol. Cell, 100，71-81.)MicroRNAs主要调节很多生物进程，包括在天然 免疫应答中许多细胞的分化和活化。(Garzon，R. and Croce, C. Μ. (2008)MicroRNAs in normal and malignant hematopoiesis. Curr. Opin. Hematol. ,15,352-358.)其中一禾中 典型的MicroRNA :MicroRNA-155是一种调节T细胞和B细胞成熟及天然免疫反应的小 分子 RNA0 (Rodriguez, A. , Vigorito, Ε. , Clare, S. , Warren, Μ. V. , Couttet, P. , Soond, D. R. , van, D. S. , Grocock, R. J. , Das, P. P. , Miska, Ε. Α. et al. 2007) Requirement ofbic/ microRNA-155for normal immune function. Science, 316,608-611.)它是一禾中免疫负向 调控分子，其主要作用是限制炎症介质的释放、激发粒细胞和单核细胞的增值来增强天然 免疫，同时使B细胞产生高亲和性的IgGl抗体，削弱Thl细胞和Th2细胞分化，T细胞正面 调节使抗原减低等方面来增强获得性免疫反应。(Mark A. Lindsay (2008) mi croRNAs andthe immune response, cell, 346-348)在生理情况下，该分子对体内免疫反应，尤其是细胞免 疫反应的自然衰减过程意义重大。有研究表明MicroRNA-155在基因敲除小鼠中可使Th2 细胞产生大量的各类细胞因子，如IL-4，IL-5，IL-IO等。(Rodriguez, A. et al. (2007) Requirement ofbic/microRNA-155 for normal immune function. Science 316,608-611) 这些细胞因子是与B细胞免疫有关的细胞因子。同时有研究表明MicroRNA-155能够下调 T淋巴细胞免疫应答，主要表现为Y干扰素(IFN-γ)及白介素2(IL-2)的减少。(Thai， Τ. H. et al. (2007)Regulation of the germinal center response by microRNA-155. Science 316，604-608)。这些发现提示，microRNA-155对抗原特异性免疫反应的建立有重 要调节作用，因此可能在疫苗领域具有很大研究和应用价值。核酸疫苗是一种重要的新型疫苗。(Donnelly，J.J.，J. B. Ulmer，J. W. Shiver, and Μ. A. Liu. DNA vaccines. Annu. Rev. Immunol.，1997，15 :617_648)由于其诱导细胞免疫反应 的特殊能力，它在某些病毒感染，胞内菌感染，肿瘤等疾病的治疗上有着特殊的意义。核酸 疫苗免疫后，产生免疫反应的主要包括天然免疫应答和获得性免疫应答。但是核酸疫苗也 存在着明显的不足，即核酸疫苗刺激机体产生免疫应答的能力往往比常规疫苗接种引起的 免疫反应弱，这就给核酸疫苗的研究提出了新的挑战。因此，核酸疫苗佐剂已成为当今倍 受关注的研究热点。目前作为核酸疫苗的佐剂主要有细胞因子、共刺激分子、CpG DNA和脂 质体(Donnelly, JJ, Wahren, B, and Liu, MA. DNA vaccines -progress andchallenges. J Immunol.，2005，175 :633_639·)。但是，现有的核酸疫苗佐剂中，并没有利用MicroRNA-155质粒载体作为疫苗佐剂的研究报道和相关专利。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有细胞免疫增强活性的利用MicroRNA-155质粒载 体的核酸疫苗佐剂及其构建方法。本专利技术鉴于MicroRNA-155在B细胞和T细胞免疫应答有重要调节意义，增强 MicroRNA-155在核酸疫苗免疫局部细胞内的表达，可能对疫苗诱导的特异性免疫增强有很Jk 眉、ο本专利技术提供了一种具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂，其特征在于该核酸疫 苗佐剂是含有可以有效表达MicroRNA-155前体分子的DNA序列的质粒，其中的DNA序列如 SEQ ID NO 4 所示。上述的质粒是pcDNA. 3. 1 (+)，本专利技术也可以用pVAXl或pEZX等其他真核表达质粒 替代。质粒也可以以腺病毒、慢病毒等替代。本专利技术还提供了上述核酸疫苗佐剂的构建方法，包括以下步骤:A)设计PCR引物 如SEQ ID NO :2或3所示，采用人外周血单核细胞抽提的基因组DNA进行PCR，得到编码 MicroRNA-155前体分子的DNA序列如SEQ ID NO 4所示；B)将上述编码MicroRNA-155前体分子的DNA序列克隆入质粒。本专利技术的具体内容如下1、首先根据互联网数据库信息查找了人类的microRNA-155前体分子序列 (GENBANK NR 030784. 1，如SEQ ID NO :1所示)，针对其侧翼基因组编码序列设计PCR引物 (上下游分别添加BamH I和EcoR I酶切位点)，采用人外周血单核细胞抽提的基因组DNA 进行PCR，克隆用PCR引物如下上游引物3，GGATCCGGTGGCACAAACCAGGAA5，(如 SEQ ID NO 2 所示)下游引物5，GAATTCTCTAAGTTTATCCAGCAGGGTG3，(如 SEQ ID NO 3 所示)从而获取了包含microRNA-155前体分子的DNA片段(如SEQ IDNO :4所示， 247bp)。2、在购自美国Invitrogene公司的商品化质粒pcDNA. 3. 1 (+)的多克隆区域连入 上述克隆的包含pre-miR-155编码序列的DNA片段(如图1所示)，采用BamH I和EcoR I 酶切位点。该插入序列侧翼的多克隆酶切位点仍然保留，可以用于插入抗原序列并不影响 其有效表达。所述即为pre-miR-155表达载体pcDNA. 3. 1-pre-miR-155 本专利技术的一种含有hsa-miR-155前体编码序列的质粒pcDNA. 3. 1-pre-miR-155, 该质粒可以在体内外高效表达人类MicroRNA-155前体分子(pre-miR-155)，并经过剪切 作用形成MicroRNA-155成熟体，体外试验中可本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
一种具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂，其特征在于该核酸疫苗佐剂是含有可以有效表达MicroRNA 155前体分子的DNA序列的质粒，其中的DNA序列如SEQ ID NO4所示。2.根据权利要求1所述的具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂，其特征在于其中的 质粒是 pcDNA. 3. 1 (+)。3.—种如权利要求1或2所述的具有细胞免疫增强活性的核酸疫苗佐剂的构建方法， 其特征在于该方法包...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙树汉，王越，唐樱歌，郭瀛军，章意亮，周奇，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31
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