大蒜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法技术

本发明专利技术属于一种药物制备方法，具体地说是一种从大蒜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法。本发明专利技术步骤是：准确称取大蒜２０重量份，粉碎至１００目，加入１１０重量份９５％乙醇浸泡２ｈ；用索氏提取器对上述样品８０℃热回流４ｈ；将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至２０重量份；将浓缩后的溶液过滤除菌，用ＤＭＥＭ培养液稀释。本发明专利技术的优点是：原料便宜，成本低；方法简单，提取方便；对丙型肝炎病毒有较好杀灭效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种药物制备方法，具体地说是一种从大蒜提取杀灭丙型肝炎病毒药 物的方法。
技术介绍
丙型肝炎是一种严重危害人类健康的疾病，难以治愈。丙型肝炎是由人体感染丙 型肝炎病毒引起的疾病。由于丙型肝炎病毒复制能力极强，病毒表面有一层坚硬外壳，一般 的药物难以渗透进病毒体内，所以病毒难以杀灭，丙型肝炎也就难以治愈。现有技术是用抗 病毒西药治疗，但是由于丙型肝炎病毒构造的特殊性，只能使患者短时期减轻症状，无法根 治疾病。所以专利技术一种从植物中提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，生产对人体无副作用， 能够有效杀灭丙型肝炎病毒的药物是一个重要的任务。大蒜是大众日常生活中喜爱的食品，长期以来被认为有抗病防病作用。近年来国 内外研究证实大蒜对一些细菌、真菌具有一定的抑菌或杀菌活性。但是对于从大蒜能够杀 灭丙型肝炎病毒则没有见报道；对于用什么方法提取大蒜中含有的杀灭丙型肝炎病毒物质 没有见报道。经检索国内外专利文献，查阅国内外公开出版物均未见有从大蒜中提取杀灭 丙型肝炎病毒药物的方法的报道。本专利技术利用安全、经济和便捷的大蒜来提取杀灭丙型肝 炎病毒的药物，对于治疗丙型肝炎具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从。本专利技术的目的是这样实现的从大蒜中提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，步骤如下(1)大蒜头去皮洗净晾干，准确称取20重量份，破碎，加入110重量份的的95%乙 醇浸泡2h ；(2)用索氏提取器对上述样品80°C热回流4h ；(3)将步骤(2)溶液过滤；滤液用旋转蒸发仪浓缩至20重量份；(4)将浓缩后的溶液过滤除菌，用DMEM培养液稀释。大蒜头为植物蒜的鳞茎。DMEM培养液为含氨基酸和葡萄糖的培养基。本专利技术的要点是将大蒜粉碎，经95%乙醇浸泡、80°C热回流、过滤、浓缩、除菌、 用DMEM培养液稀释制成。临床使用时根据需要配制成不同浓度药物。DMEM培养液是一种富含氨基酸和葡萄糖的培养基，其特点是氨基酸和维生素含 量高；含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸；含有微量的铁离子。本专利技术利用国际上最新的能高效产生有体外感染活性的HCV病毒颗粒(HCVcc)的 Huh-7. 5. 1细胞模型为平台，IFA实验结果表明蒜液在20mg/ml浓度时能抑制细胞内HCV增 殖，在低浓度时无效。3本专利技术的具体实施如下；将Huh-7. 5. 1细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中于37°C、5% C02 (C02)饱 和湿度的培养箱中培养，细胞培养液中添加100i! g/ml的链霉素和100U/ml的青霉素。此 细胞为贴壁细胞，培养3天后，用0. 25%胰蛋白酶消化进行传代培养。HCVcc滴度为每毫升 培养上清105感染单位，保存于-80°C冰箱备用。大蒜购于农贸市场，洗净、晾干。称取大蒜20g，粉碎后用95%乙醇120ml浸泡 2h。丁香20g两份，粉碎后一份用120ml 95%乙醇浸泡、另一份用120ml纯水浸泡2h。随 后用索氏提取器对样品分别进行80°C热回流4h，再过滤，将每份样品液用旋转蒸发仪浓缩 至20ml，此为提取原液即1ml提取液含lg原材料的提取物，浓度为lg/ml。在细胞室内 将提取原液进行过滤除菌后，分别用DMEM培养液进行1 10、1 50,1 100,1 200、 1 1000 稀释，得到浓度分别为 100mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、lmg/ml 的大蒜提取 液，以下简称为蒜液。大蒜提取液处理HCVcc具有一定的直接杀灭效果。虽不能阻断Huh-7. 5. 1细胞感 染HCVcc，但能抑制感染细胞内病毒的增殖，其机制是影响病毒RNA的合成。本专利技术的优点是1、原料便宜，成本低。2、方法简单，提取方便。3、对丙型肝炎病毒有直接杀灭效果。具体实施例方式下面通过具体实施方式对本专利技术做进一步说明。实施例1 提取液对Huh-7. 5. 1细胞毒性测定用胰酶消化Huh-7. 5. 1细胞，按2X104/孔的密度接种至96孔细胞培养板，置5% C02培养箱37°C培养6h，待细胞贴壁后，在每孔中分别加入不同浓度的各类提取液lOiil， 37°C培养过夜，在每孔中加入lOiUCCK-8试剂，继续培养4h。同时设立阴性对照，将未加提 取液的细胞孔，加CCK-8 ；空白对照，没有细胞，加DMEM培养液，加CCK-8。用酶标仪测定各 孔450nm吸光度值(0D值)。实施例2 大蒜提取液抗病毒活性为筛选提取液有无抗HCV活性，以及发挥抗病毒作用的途径，设计以下三组平行 实验第一组杀灭病毒取3个浓度20mg/ml、5mg/ml、lmg/ml的大蒜提取液各10 u 1首先和10 u 1 HCVcc 等量混合，37°C作用4h后，再接种到96孔板内，其中Hoh-7. 5. 1细胞密度为3X104/孔， 下同。培养72h后，进行IFA实验，检测细胞内HCV蛋白表达。以HCVcc直接感染的一个孔 为阳性对照、以未加提取液、病毒的一个孔为阴性对照。第二组阻断病毒感染将lOiU不同浓度提取液首先加到含有Huh-7. 5. 1细胞的96孔板内，培养过夜，弃培养液，用PBS洗涤3次，每孔添加100 μ 1培养液后再加10 μ 1 HCVcc进行病毒感染，同 时设立阳性、阴性对照。培养72h后进行IFA检测。第三组抑制病毒增殖将10 μ 1 HCVcc感染96孔板内的Huh_7. 5. 1细胞，培养6h，弃培养液，用PBS洗 涤3次，每孔添加100 μ 1培养液后再加10 μ 1不同浓度提取液，同时设立阳性、阴性对照， 培养72h后进行IFA检测。实施例3 IFA检测将96孔板中的培养上清吸掉，每孔加入100μ 1甲醇，置-20°C固定 20min，PBS洗涤3次每次3min。每孔加入用PBS配制的0. 1% TritonX-100 () 100 μ 1，室温 透化30min，PBS洗涤(3minX3次)。每孔加入100 μ 1封闭液(含3% BSA的PBS)，室温 封闭1小时。吸掉封闭液；每孔加入丙型肝炎患者血清50μ1 (用封闭液做1 50稀释的 血清，作为第一抗体)，室温孵育2h，PBS洗涤3次，每次lOmin。每孔加入荧光素FITC标记 的抗人IgG作为第二抗体，避光孵育1小时，PBS洗涤(3minX3次)。实施例4 提取液对Huh-7. 5. 1细胞的毒性按〔(实验孔OD值-空白对照孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白对照孔OD 值)〕X 100%来计算细胞存活率，表明细胞存活率大于84%，显示提取液对Huh-7. 5. 1细胞 基本无毒性作用。因此在后续的抗病毒活性研究中，大蒜提取液均选择20mg/ml、5mg/ml、 lmg/ml等三个浓度。实施例5 提取液对HCVcc的直接杀灭效果第一组IFA实验结果显示，蒜液20mg/ml孔为阴性，5mg/ml、lmg/ml两孔阳性细胞 分别为5%、8%。与阳性对照孔相比(阳性细胞约60%)。表1大蒜提取液对Huh-7. 5. 1细胞的毒性测定(0D值/45(1)提取液种类提取液浓度(mg/ml) 100 20 10 5 1阴性 对照空白 对照蒜液1. 307 1. 306 1.348 1.257 1. 3421. 4180. 038实施例6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从大蒜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，步骤如下：（１）大蒜头去皮洗净晾干，准确称取２０重量份，破碎，加入１１０重量份的的９５％乙醇浸泡２ｈ；（２）用索氏提取器对上述样品８０℃热回流４ｈ；（３）将步骤（２）溶液过滤；滤液用旋转蒸发仪浓缩至２０重量份；（４）将浓缩后的溶液过滤除菌，用ＤＭＥＭ培养液稀释。

【技术特征摘要】
一种从大蒜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，步骤如下(1)大蒜头去皮洗净晾干，准确称取20重量份，破碎，加入110重量份的的95％乙醇浸泡2h；(2)用索氏提取器对上述样品80℃热回流4h；(3)将步骤(2)溶液过滤；滤液用旋转蒸发仪浓缩至20重量份；(4)将浓缩后的溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚传凤，杨宇，
申请(专利权)人：姚传凤，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]