糖链衍生物的制造方法、结构解析方法、以及糖链衍生物技术

本发明专利技术涉及糖链衍生物的制造方法，是从糖链混合物制造糖链衍生物的方法，其特征在于，具备下述工序：（ａ）在糖链混合物中的糖链上导入脂溶性基，得到糖链衍生物的混合物的工序，以及（ｂ）将该糖链衍生物的混合物用５－羟色胺亲合柱色谱法处理的工序。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及来自糖链的混合物的糖链衍生物的制造方法、以及糖链的结构解析方 法。进一步，涉及根据本专利技术的糖链衍生物的制造方法制造的新的糖链衍生物。
技术介绍
糖蛋白质中的糖链认为具有保持蛋白质的立体结构、获得防止被蛋白酶的分解的 抵抗性等作用。最近，逐渐地阐明了糖蛋白质中的糖链参与受精和分化、信号传导、癌化、蛋 白质的细胞内输送和生理活性的调节等的生命现象。另外，还阐明了细胞表面的粘接分子 和糖蛋白质性激素等的糖链与其功能的关系，总结了糖质科学公会(consortium)构想。现 在，糖链功能研究的中心研究以影响其的生合成糖转移酶(糖链基因)为中心，如果考虑糖 转移酶还根据基因组情报被保存，利用与其他蛋白质的协调作业，参与生命功能，还需要利 用捕捉细胞、组织中表达的糖链的整体图像进行解析的结构糖组学(glyconomics)手法， 进行糖链的功能解析。糖链科学中的结构糖组学的作用是综合地解析在多数生命现象中担负重要作用 的糖链识别机理，对功能糖组学是不可缺少的要素。作为结构糖组学所要求的技术的要素， 有高综合性、高生产量、高感度以及高精度。现在，作为糖蛋白质糖链的结构解析法，对从蛋白质切出的糖链进行荧光标记后， 利用高效液相色谱(HPLC)或者质谱分析法(MS)的解析的方法成为利用质谱分析的快速技 术进步的有力的手段(非专利文献1 4)，唾液酸糖链的分离中，逐渐地专门地利用阴离子 交换色谱色谱(非专利文献5)。非专利文献1Biomed Chromatogr. 16 103-115 (2002)非专利文献2Anal Biochem. 206 :278_287 (1992)非专利文献3Biochem Soc Trans. 21 121-125 (1993)非专利文献4Chem Rev. 102 :321_369 (2002)非专利文献5Biochim Biophys Acta. 705 167-173 (1982)但是，对细胞或组织中的糖链综合解析的场合，由于存在唾液酸和岩藻糖等的非 还原末端修饰的多样性和糖链的分枝这样的问题，不能充分地分离混合存在的糖链，不能 得到满意的结果。特别地，如果使用离子交换色谱等，由于没有特异的分离能力，不仅不能 获得充分的分离，而且分离操作后必须要进行脱盐处理，可以说并不是实用的方法。因此，对这些的糖链不均一性情报有担心，同时迫切希望对细胞、组织可以详细进 行特征糖链结构解析的实用的手法。本专利技术的课题在于，提供从像细胞或者组织中的糖链那样混合存在的各种的糖链 的状态分离、获取各糖链的手段。另外，本专利技术课题在于，提供对于分离的各糖链化合物的结构进行解析的手段。进一步，本专利技术的课题在于提供新的糖链衍生物。
技术实现思路
本专利技术涉及以下的专利技术。1.糖链衍生物的制造方法，是从糖链混合物制造糖链衍生物的方法，其特征在于， 包括下述工序(a)在糖链混合物中的糖链上导入脂溶性基，得到糖链衍生物的混合物的 工序、以及(b)将该糖链衍生物的混合物用5-羟色胺(serotonin)亲合柱色谱法进行处理 的工序。2.上述1记载的糖链衍生物的制造方法，其中在(b)工序之后具备(C)采用氨基 柱或者酰氨基柱的正相色谱法进行处理的工序。3.上述记载的糖链衍生物的制造方法，其中，在(C)工序之前，具备(d)用糖水解 酶进行处理的工序。4.糖链的结构解析方法，是解析糖链混合物中的糖链的结构的方法，其特征在于， 具备以下工序(a)在糖链混合物中的糖链上导入脂溶性基，得到糖链衍生物的混合物的 工序、(b)将该糖链衍生物的混合物用5-羟色胺亲合柱色谱法进行处理的工序、以及(e)用 质谱分析法进行处理的工序。5.上述记载的糖链的结构解析方法，其特征在于，在(b)工序之后，具备(C)通过 采用氨基柱或者酰氨基柱的正相色谱法进行处理的工序。6.上述记载的糖链的结构解析方法，其中，在(C)工序之前具备(d)用糖水解酶进 行处理的工序。7.上述4记载的糖链的结构解析方法，其中，质谱分析法是利用MALDI-TOF MS的 质谱分析法。8.后述的式(1) (6)表示的糖链衍生物[式中R1表示2-羧基苯基、3-羧基苯 基、4-羧基苯基、ρ-乙氧基羰基苯基、或者2-吡啶基。R2表示羟基、基-Asn或者基-Asn-R3。 在此，Asn表示天冬酰胺基，R3表示氨基甲酸酯系或者酰胺系保护基。Ac表示乙酰基。]。9.由式(1) (6)表示的糖链衍生物衍生的癌标记物。本专利技术人等经过深入研究，结果发现在糖链上导入脂溶性基成为糖链衍生物后， 采用把对唾液酸有亲合性的5-羟色胺作为配基的亲合柱色谱法进行处理，由此可以进行 无唾液酸糖链和唾液酸糖链的分离，还可以利用唾液酸残基的数目对唾液酸糖链中的单唾 液酸、二唾液酸、三唾液酸以及四唾液酸糖链等进行分离。进一步还发现，把利用该亲合柱色谱法分离的级分，分别供给使用氨基柱或者酰 氨基柱的色谱，将分枝结构不同的糖链衍生物可以进行详细分离，可以大量地制造单一结 构的糖链。另外还发现，使分离的各糖链衍生物与适当的糖水解酶作用，供给采用氨基柱或 者酰氨基柱的色谱进行分离，对得到的糖链衍生物用质谱分析法进行处理，由此可以高精 度且综合地解析糖链结构，进而完成了本专利技术。在本专利技术的制造方法中使用的糖链混合物的糖链没有特别的限制，包括天冬酰胺 键合型糖链(N-葡糖甙键合型糖链)、muCin型糖链(0-葡糖甙键合型糖链)、游离型糖链、 进一步还包括像糖链键合天冬酰胺那样的结合了氨基酸的糖链。这些糖链也可以是利用化学的手法调制的糖链，例如，从天然的糖蛋白质由来的 糖链在其非还原末端的糖残基随机欠失的糖链的混合物，优选使用这些糖链的混合物。此外，优选使用含有在糖链残基上具有唾液酸残基的糖链的糖链混合物。作为天然糖链的混合物，可举出天然原料、例如乳汁、牛由来胎球蛋白、卵或者生 体的组织或细胞由来的糖链混合物。特别地，使用癌组织或者癌细胞由来的糖链混合物可 以期待特别浓厚兴趣的结果。作为本专利技术中可以使用的天然糖链的混合物，可优选以下所示的糖链混合物，特 别优选含有唾液酸糖链的糖链混合物。可以使用下述获得的混合物，S卩，从该天然原料中利用公知的方法获得糖蛋白质 以及/或者糖肽的混合物，使当该混合物与蛋白质分解酶等作用，切断肽部分，利用采用凝 胶过滤柱或者离子交换柱等的色谱法进行精制获得的糖链键合天冬酰胺的混合物。另外，可以使用下述获得的混合物，S卩，采用例如生体的组织或者细胞、特别是培 养组织或培养细胞，将培养液中的组织或者细胞勻化，然后将离心分离获得的细胞膜级分， 用2-巯基乙醇处理后，使作用于N-聚糖酶(glycanase)，得到的糖链的混合物。另外，可以使用将培养组织或培养细胞勻化，采集离心分离的上清液获得的游离 糖链的混合物。在这些的糖链之中由于含有作为中性糖链的高甘露糖型糖链和多种唾液酸 糖链，所以适用于各种糖链的制造。在获得的糖链的混合物中的糖链上导入脂溶性基使其成为糖链衍生物的混合物。脂溶性基是与糖链的还原末端的开环醛、糖链键合天冬酰胺的天冬酰胺氨基或者 羧基反应形成的、具有脂溶性的取代基，例如2-、3_或者4-羧基苯基氨基、ρ-乙氧基羰基苯 基氨基、2-吡啶基氨基等作为通常荧光标记使用的取代基、或者9本文档来自技高网...

【技术保护点】
癌细胞由来的糖链的结构解析方法，是解析癌细胞由来的糖链混合物中的糖链的结构的方法，其特征在于，具备以下工序：（ａ）在癌细胞由来的糖链混合物中的糖链上导入脂溶性基，得到糖链衍生物的混合物的工序、（ｂ）将该糖链衍生物的混合物用５－羟色胺亲合柱色谱法进行处理的工序、以及（ｅ）用质谱分析法进行处理的工序。

【技术特征摘要】
JP 2005-7-19 2005-209077癌细胞由来的糖链的结构解析方法，是解析癌细胞由来的糖链混合物中的糖链的结构的方法，其特征在于，具备以下工序(a)在癌细胞由来的糖链混合物中的糖链上导入脂溶性基，得到糖链衍生物的混合物的工序、(b)将该糖链衍生物的混合物用5 羟色胺亲合柱色谱法进行处理的工序、以及(e)用质谱分析...

【专利技术属性】
技术研发人员：挂樋一晃，木下充弘，松野裕树，
申请(专利权)人：大塚化学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]