从丁香中提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法技术

本发明专利技术属于一种药物制备方法，具体地说是一种从丁香提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法。准确称取丁香２０重量份，粉碎至１００目，加入１１０重量份９５％乙醇１２０克浸泡２ｈ；用索氏提取器对上述样品进行８０℃热回流４ｈ；将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至２０重量份；将浓缩后的溶液过滤除菌，用ＤＭＥＭ培养液稀释。本发明专利技术丁香醇提杀灭丙型肝炎病毒药物为优选药物。本发明专利技术的优点是：原料便宜，成本低；方法简单，提取方便；对丙型肝炎病毒有直接杀灭效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种药物制备方法，具体地说是一种从丁香中提取杀灭丙型肝炎病毒 药物的方法。
技术介绍
丙型肝炎是一种严重危害人类健康的疾病，难以治愈。丙型肝炎是由人体感染丙 型肝炎病毒引起的疾病。由于丙型肝炎病毒复制能力极强，病毒表面有一层坚硬外壳，一般 的药物难以渗透进病毒体内，所以病毒难以杀灭，丙型肝炎也就难以治愈。现有技术是用抗 病毒西药治疗，但是由于丙型肝炎病毒构造的特殊性，只能使患者短时期减轻症状，无法根 治疾病。所以专利技术一种从植物中提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，生产对人体无副作用， 能够有效杀灭丙型肝炎病毒的药物是一个重要的任务。丁香等可食性植物是大众日常生活中喜爱的香辛料调味品。长期以来被认为有抗 病防病作用。近年来国内外研究证实香辛料对一些细菌、真菌具有一定的抑菌或杀菌活性。 但是对于从丁香能够杀灭丙型肝炎病毒则没有见报道；对于用什么方法提取丁香中含有的 杀灭丙型肝炎病毒物质没有见报道。经检索国内外专利文献，查阅国内外公开出版物均未 见有从丁香提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法的报道。本专利技术利用安全、经济和便捷的丁 香来提取杀灭丙型肝炎病毒的药物，对于治疗丙型肝炎具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从丁香提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法。本专利技术的目的是这样实现的从丁香提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，步骤如下(1) 丁香醇提杀灭丙型肝炎病毒药物a.准确称取丁香20重量份，粉碎至100目，加入110重量份95%乙醇浸泡2h ；b.用索氏提取器对上述样品80°C热回流4h ；c.将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至20重量份；d.将浓缩后的溶液过滤除菌，用DMEM培养液稀释；(2) 丁香水提杀灭丙型肝炎病毒药物a.准确称取丁香20重量份，粉碎至100目，加入120重量份的纯水浸泡2h ；b.用索氏提取器对上述样品80°C热回流4h ；c.将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至20重量份；d.将浓缩后的溶液过滤除菌，用DMEM培养液稀释。丁香为丁香植物的种子。DMEM培养液为富含氨基酸和葡萄糖的培养基。本专利技术的要点是将丁香粉碎，经95%乙醇浸泡、80°C热回流、过滤、浓缩、除菌、 用DMEM培养液稀释制成。临床使用时根据需要配制成不同浓度药物。丁香取植物丁香的种子。DMEM培养液是一种富含氨基酸和葡萄糖的培养基，其特点是氨基酸和维生素含 量高；含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸；含有微量的铁离子。本专利技术利用国际上最新的能高效产生有体外感染活性的HCV病毒颗粒(HCVcc)的 Huh-7. 5. 1细胞模型为平台，IFA实验结果表明各种丁香提取液对HCVcc杀灭作用的效果 为丁香醇提液>丁香水提液。阻断实验显示细胞经过提取液处理后均不能阻止HCVcc的感 染。丁香水提液在20mg/ml浓度时能抑制细胞内HCV增殖，在低浓度时无效。丁香醇提液 在低浓度下则有明显的抑制效果。表明丁香抗病毒成分多以醇溶形式存在。三种浓度丁香 醇提液作用于细胞后，经荧光定量PCR检测显示细胞内HCV RNA水平显著下降，显示丁香液 能有效抑制病毒RNA的复制且呈剂量依赖，证实丁香提取液抑制HCV增殖是通过影响病毒 复制环节而实现的。表明丁香抗HCV活性强。我们利用HCV体外细胞培养模型Huh-7. 5. 1细胞为平台，采用免疫荧光染色 法(Immunofluorescence assay, I FA)禾口焚光定量 PCR(fluorescentquantitative PCR, FQ-PCR)等技术，以丁香提取液为研究对象，在国内首次提取抗丙型肝炎病毒的活性药物。本专利技术的具体实施如下；将Huh-7. 5. 1细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中于37°C、5% C02 (CO2)饱 和湿度的培养箱中培养，细胞培养液中添加100μ g/ml的链霉素和100U/ml的青霉素。此 细胞为贴壁细胞，培养3天后，用0. 25%胰蛋白酶消化进行传代培养。HCVcc滴度为每毫升 培养上清IO5感染单位，保存于-80°C冰箱备用。香辛料提取液的制备丁香购自药房。取丁香40g，分成两份，每份20g，粉碎后一份用120ml 95%乙醇(约IlOg)浸泡、 另一份用120ml纯水浸泡2h。随后用索氏提取器对2份样品分别进行80°C热回流4h，再过 滤，将每份样品液用旋转蒸发仪浓缩至20ml，此为提取原液即Iml提取液含Ig原材料的 提取物(浓度为lg/ml)。在细胞室内将4份提取原液进行过滤除菌后，分别用DMEM培养液 进行 1 10、1 50,1 IOOU 200,1 1000 稀释，得到浓度分别为 100mg/ml、20mg/ ml、10mg/ml、5mg/ml、lmg/ml的提取液，以下简称为丁香醇提液、丁香水提液。丁香提取液处理HCVcc具有直接杀灭效果。虽不能阻断Huh-7. 5. 1细胞感染 HCVcc，但能抑制感染细胞内病毒的增殖，其机制是影响病毒RNA的合成。本专利技术的优点是1、原料便宜，成本低。2、方法简单，提取方便。3、对丙型肝炎病毒有直接杀灭效果。具体实施例方式下面通过具体实施方式对本专利技术做进一步说明。实施例1 提取液对Huh-7. 5. 1细胞毒性测定用胰酶消化Huh-7. 5. 1细胞，按2X IO4/孔的密度接种至96孔细胞培养板，置5% CO2培养箱37°C培养6h，待细胞贴壁后，在每孔中分别加入不同浓度的各类提取液10 μ 1，37°C培养过夜，在每孔中加入10μ1 CCK-8试剂，继续培养4h。同时设立阴性对照，未加提 取液的细胞孔，加CCK-8、空白对照。用酶标仪测定各孔450nm吸光度值OD值。实施例2 丁香提取液抗病毒活性为筛选丁香提取液有无抗HCV活性及其作用的强弱，以及发挥抗病毒作用的途 径，设计以下三组平行实验第一组杀灭病毒四类提取液均取3个浓度20mg/ml、5mg/ml、lmg/ml各10μ 1首先和10 μ 1 HCVcc 等量混合，37°C作用4h后，再接种到96孔板内，其中Hoh 7. 5. 1细胞密度为3 X IO4/孔。 培养72h后，进行IFA实验，检测细胞内HCV蛋白表达。以HCVcc直接感染的一个孔为阳性 对照、以未加提取液、病毒的一个孔为阴性对照。第二组阻断病毒感染将10 μ 1不同浓度提取液首先加到含有Huh-7. 5. 1细胞的96孔板内，培养过夜， 弃培养液，用PBS洗涤3次，每孔添加100 μ 1培养液后再加10 μ 1 HCVcc进行病毒感染，同 时设立阳性、阴性对照。培养72h后进行IFA检测。第三组抑制病毒增殖将10 μ 1 HCVcc感染96孔板内的Huh_7. 5. 1细胞，培养6h，弃培养液，用PBS洗 涤3次，每孔添加100 μ 1培养液后再加10 μ 1不同浓度提取液，同时设立阳性、阴性对照， 培养72h后进行IFA检测。实施例3 IFA检测将96孔板中的培养上清吸掉，每孔加入100μ 1甲醇，置-20°C固定 20min，PBS 洗涤(3minX3 次)。每孔加入 0. 1 % TritonX-100 (用 PBS 配制)100 μ 1，室温 透化30min，PBS洗涤3min/次X 3次。每本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从丁香提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，步骤如下：（１）丁香醇提杀灭丙型肝炎病毒药物：ａ．准确称取丁香２０重量份，粉碎至１００目，加入１１０重量份９５％乙醇浸泡２ｈ；ｂ．用索氏提取器对上述样品８０℃热回流４ｈ；ｃ．将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至２０重量份；ｄ．将浓缩后的溶液过滤除菌，用ＤＭＥＭ培养液稀释；（２）丁香水提杀灭丙型肝炎病毒药物：ａ准确称取丁香２０重量份，粉碎至１００目，加入１２０重量份的纯水浸泡２ｈ；ｂ．用索氏提取器对上述样品８０℃热回流４ｈ；ｃ将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至２０重量份；ｄ将浓缩后的溶液过滤除菌，用ＤＭＥＭ培养液稀释。

【技术特征摘要】
一种从丁香提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，步骤如下(1)丁香醇提杀灭丙型肝炎病毒药物a.准确称取丁香20重量份，粉碎至100目，加入110重量份95％乙醇浸泡2h；b.用索氏提取器对上述样品80℃热回流4h；c.将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至20重量份；d.将浓缩后的溶液过滤除菌，用DMEM培养液稀释；(2)丁香水提杀灭丙型肝炎病毒药物a准确称取丁香20重量份，粉碎至100目...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚传凤，杨宇，
申请(专利权)人：姚传凤，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]