含有寡核苷酸的微球体及其在制备用于治疗1型糖尿病的药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及包含用于治疗１型糖尿病的寡核苷酸的微球体，基于微球体的总重量所述寡核苷酸占微球体的约３０重量百分数至约１００重量百分数，所述微球体平均粒度不大于约５０微米。所述寡核苷酸靶向结合初级转录物ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６和它们的组合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术广泛地涉及AS-寡核苷酸的微球体递送以诱导树突状细胞的耐受性，尤其是在非肥胖糖尿病的(NOD)小鼠模型中。更特别地，本专利技术涉及通过利用完全水溶性条件制备的微球体的药物递送技术，其中微球体中引入了反义(AS)寡核苷酸。这些微球体用作反义方法以预防NOD小鼠体内和原位的自身免疫糖尿病症状。
技术介绍
微粒、微球体和微囊是固体或者半固体的粒子，它们的直径小于1毫米，更优选小于100微米，可以由各种原料形成，包括合成的聚合物、蛋白质和多糖。微球体已经在许多不同的应用中使用，主要是分离、诊断和药物递送。可以使用多种不同的技术从合成的聚合物、天然的聚合物、蛋白质和多糖来制备这些微球体，包括相分离、溶剂蒸发，乳化和喷雾干燥。通常聚合物形成了这些微球体的支撑结构，感兴趣的药物被加入聚合物结构中。用来形成微球体的示例性聚合物包括，如Ruiz在美国专利号5,213,812、Reid等在美国专利号5,417,986、Tice等在美国专利号4,530,840、Tice等在美国专利号4,897,268、Tice等在美国专利号5,075,109、Singh等在美国专利号5,102,872、Boyes等在美国专利号5,384,133、Tice等在美国专利号5,360,610和Southern ResearchInstitute的欧洲专利申请公开号248,531中描述的乳酸和羟基乙酸的均聚物和共聚物(PLGA)；嵌段共聚物如Illum在美国专利号4,904,479中描述的tetronic 908和poloxamer 407；和Cohen等在美国专利号5,149,543中描述的聚偶磷氮(polyphosphazene)。使用这些聚合物制备的微球体表现低的负载效率，常常仅能在聚合物结构中掺入少量百分数的感兴趣药物。因此实际上必须常常给予大量的微球体以达到治疗效果。多年来，生物化学家们已经可在市场上买到球形珠子或者粒子作为一种工具。例如，结合到珠子上的抗体形成特异于特定配体的相对大的粒子。大的抗体包覆颗粒通常用于交联细胞表面上的受体用于细胞的活化，它们被结合在固相上用于免疫亲和纯化，和使用结合到颗粒的组织或者肿瘤特异性的抗体将药剂靶向需要的位置，可以用于递送随着时间缓慢释放的治疗剂。目前可得到的微粒或者珠子的一个缺点是它们生产困难和代价高。通过这些已知的方法生产的微粒有一个宽的粒度分布，常常缺乏一致性，当活性成分处于高浓度时不能显示出长期的释放动力学。而且，用于这些已知方法的聚合物需要溶于有机溶剂中以形成微粒。因此它们必须在设计成能操作有机溶剂的特殊设备中生产。这些有机溶剂可以使包含于微粒中的蛋白质或者肽变性。当给予人类或者动物药物时，残留的有机溶剂会导致毒性。另外，可得到的微粒很少是能充分地小到适合穿过针孔大小的尺寸，这种尺寸通常用于给予治疗或者适用于经吸入给药。例如，使用聚乳酸羟基乙酸(PLGA)制备的微粒尺寸大并有积聚的倾向。用于注射时，为除去太大的粒子必需采用会导致产品损失的尺寸选择步骤。具有用于注射的适当尺寸的PLGA粒子必须被通过大规格针给药以适应大的颗粒尺寸，这常常引起病人的不适。通常，许多现在可用的微粒在水性介质中被激活释放出它们的内容物，因此必须把它们冻干以预防预先释放。另外，粒子如使用PLGA体系制备的那些显示出基于侵蚀和扩散的释放动力学。在这类体系中，观察到初始的破裂或者迅速地释放药物。这种破裂效力可以导致对已经被给予粒子的病人有害的副作用。使用脂质制备的装入靶药物的微粒是已知的。例如，排列在环绕多重含水态区室的双层膜中形成粒子的脂质可被用来装入水溶性的药物用于连续的递送，如Sinil Kim在美国专利号5,422,120中所描述的。这些粒子的尺寸通常大于10微米，被设计用于关节内、鞘内、皮下和硬膜外给药。做为选择，脂质体已经被用于静脉内递送小分子。脂质体呈球状颗粒，由单一或者多重的磷脂和胆固醇双分子层组成。脂质体的尺寸在30微米或者更大，可以携带各种水溶性的或者脂溶性的药物。包括脂质组分的纯度、潜在的毒性、小泡异质性和稳定性、过量的摄入和制造或贮藏期限困难等问题阻碍了脂质体技术。医药群体的一个目标是递送核酸到动物的细胞用于糖尿病治疗。例如，核酸可以被相对有效地递送到培养基中的细胞(体外)，但是当核酸被递送给动物(体内)时，核酸酶导致高速的核酸降解。除了保护核酸免于核酸酶消化之外，核酸的运载工具必须显示低毒，必须被细胞有效地接纳和有一种明确的、容易被制备的制剂。如临床试验所示，用于递送的病毒载体可以导致体内严重有害的、甚至致命的免疫反应。另外，这些方法在体内有诱导突变效应的可能。经由不同制剂的脂质复合物(如脂质体或者阳离子的脂质复合物)中包装核酸进行递送在体内通常是无效的，并可能产生毒性效应。核酸与各种聚合物或者与肽的复合物显示出不一致的结果，这些制剂的毒性还没有被解决。核酸也已经被装入聚合物基质中用于递送，但是在这些例子中，粒子具有宽的粒度范围，用于治疗应用的有效性还没有被证明。因此，存在解决核酸递送问题的需要，并有需要进行微球体的开发和发展用于制造微球体的新方法。与微球体有关的细节可以参见Scott等在美国专利号6,458,387、Woiszwillo等在美国专利号6,268,053、6,090,925、5,981,719和5,599,719以及Woiszwillo在美国专利号5,578,709中的描述。这些和这里确定的所有参考文献被合并入本文中作为参考。专利技术概要根据本专利技术，被递送给树突状细胞的DNA以微球体进行递送。据信这样的递送方式防止了核酸酶接近微球体内部的核酸。有关AS-寡核苷酸的微球体递送，特别是在NOD鼠模型中进行，以诱导树突状细胞的耐受性。微球体是利用含水条件制备的，其中掺入了反义(AS)寡核苷酸。这些微球体被用于体内和原位抑制基因表达和防止NOD小鼠的自身免疫糖尿病症状。在本专利技术的一个优选方面，靶向CD40、CD80和CD86初级转录物的三种AS-寡核苷酸被合成，寡核苷酸混合物的水溶液被制备并与聚合物溶液混合。加工之后，提供包含寡核苷酸的微球体并被施用给NOD小鼠。通过考虑以下详细的说明，本专利技术的这些和其它方面、目的、特征和优点包括各种组合，将是显而易见的并能清楚地被理解。附图简要说明在说明的过程中，将引用附图，其中附图说明图1是树突状细胞在1型糖尿病中在胰腺胰岛素生成β-细胞的自身免疫破坏中的作用的示意图；图2是包含β-半乳糖苷酶基因的质粒载体的图表；图3显示了提供用质粒DNA微球体的转染NIH 3T3成纤维细胞的证据的显微照片；图4是裸质粒DNA和两个根据本专利技术的质粒DNA微球体制剂在接触DNAase后的琼脂糖电泳凝胶的显微照片；图5是在四种不同的质粒DNA应用中β-半乳糖苷酶活性的柱状图表；图6是AS-寡核苷酸和聚L-赖氨酸聚阳离子的微球体的扫描电子显微照片；图7是AS-寡核苷酸和聚L-鸟氨酸聚阳离子的微球体的扫描电子显微照片显微照片；和图8是概述在用微球体和按照用于递送三个初级转录物的其它方法处理的三个NOD小鼠组中糖尿病发生率的绘图。优选实施方案的描述根据需要，本专利技术详细的技术方案在这里公开；然而，可以理解的是这里所公开的技术方案仅仅是本专利技术的示例，它们可以以各本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含寡核苷酸的用于治疗１型糖尿病的微球体，所述寡核苷酸基于微球体总重量占所述微球体的约３０重量百分数和约１００重量百分数之间的，所述的微球体具有的平均粒度不大于约５０微米。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：特伦斯L斯克特，黛博拉拉弗里尼埃，尼克吉安努卡基斯，韦雷德比什克利布，拉里R布朗，珍妮弗梅琴，
申请(专利权)人：巴克斯特国际公司，巴克斯特医疗保健股份有限公司，匹兹堡儿童医院，
类型：发明
国别省市：US[美国]