一种柔红霉素发酵液提取纯化工艺改进方法技术

本发明专利技术属医药技术领域，具体涉及一种抗肿瘤药物柔红霉素的制备方法，本发明专利技术发酵液提取纯化包括发酵液过滤、大孔树脂吸附纯化及乙二胺四乙酸盐络合除杂质几个过程，通过控制ｐＨ值、对发酵液和树脂柱预处理等方法，达到良好的纯化柔红霉素的技术效果，杂质Ｂ降至０．５％以下，炽灼残渣降至０．１％以下。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属医药
，具体涉及一种抗肿瘤药物柔红霉素的制备方法。
技术介绍
柔红霉素(Daunorubicin，DNR)，又称道诺霉素(Daunomycin)，是从波赛链霉 菌(Str印tomyces peucetius)培养物中分离得到的一种蒽环类抗生素。化学名为 10--7，8，9，10-四氢-6，8，11-三 羟基-8-乙酰基-1-甲氧基-5，12萘二酮的盐酸盐，化学结构式如下<formula>formula see original document page 3</formula>柔红霉素是上世纪八十年代意大利Farmitalia CarloErba公司上市的抗生素类 药物，DNR分子含多种功能基团，其糖苷配基(又称道诺霉酮Daimomycinone)是荧光发色 团，环A处于半椅式构象，C8原子几乎伸出环平面外。配基为脂溶性，通过环上羟基与水溶 性的氨基糖(道诺糖胺Daimosamine)相连接，氨基糖的氨基的碱性和配基上羧基的酸性使 DNR分子呈两性。此外，分子又同时具有氧化和还原基团。所有这些化学特征使DNR在体内 表现出复杂的生化效应，DNR广泛应用于癌症化疗，对多种实验肿瘤有显著疗效，如对小鼠 艾氏腹水癌、肝癌AH130、大鼠骨髓瘤(腹水型)均有抑制作用；对艾氏腺癌(实体型)、肉 瘤180、Walker 256瘤亦有抑制作用，临床上DNR主要用于治疗急性非淋巴细胞性白血病， 对儿童白血病有良好的缓解作用，DNR的作用对象包括DNA、膜磷脂及蛋白质，DNR嵌入DNA 分子，干扰复制与转录过程，并通过TopII媒介或氧自由基诱导DNA链断裂。DNR与膜磷脂 作用影响胞内信息通路，与多种蛋白质间也存在相互作用，并诱导细胞凋亡。随着时代的发展，人类对药品质量的要求越来越高，柔红霉素中杂质的毒性较强， 所以原料的纯化成为制备柔红霉素的关键，特别是杂质B和柔红霉素的分子结构比其他杂 质更接近，如下式II所示，当基团R为-CH0H-CH3时为杂质B，当基团R为-C0-CH3时为柔红 霉素，因此传统工艺中杂质B通常难以去除。根据欧洲药典EP6.0杂质B允许限度为1.5%， 而其他杂质的允许限度为0.5%。传统工艺仅能使杂质B< 1.5%，鉴于杂质B毒性较强， 其含量亦有待于降至0.5%以下。II国家食品药品质量监督管理局已经将炽灼残渣检验标准用于盐酸柔红霉素的GMP 认证中，炽灼残渣应低于0. 1%。由于柔红霉素分子本身有一定的络合金属离子的能力(参 考专利IE44689B1)，如式III所示，其中字母‘M’表示金属离子，可见有3个部位可以络合 金属离子，但至今尚没有文献报道去除被络合的金属离子的方法。传统工艺没有去除被络 合的金属离子的步骤，因此常导致炽灼残渣超标。<image>image see original document page 4</image>目前国内外实现了柔红霉素的工业化生产，提取工艺多根据柔红霉素在碱性条件 下溶于有机溶剂，酸性条件下溶于水的特性进行萃取纯化。美国专利US3989598报道了一种柔红霉素的精制工艺，发酵液经过连续过滤处 理，用Amberlite IRC-50树脂纯化，用氯仿萃取，浓缩，酸化，最后从氯仿和甲醇混合液中结 晶。收率57%，纯度82%，总有关物质2.2%，水分2.6%，氯仿残留14%，。本方法的缺点 是收率低，杂质较高，特别是杂质B的含量较难达到药典标准，且氯仿残留太高。Drug Resarch, vol.58 No. 4 PP263-268.2001，THE METHOD OF DAUNOMYCIN PURIFICATION报道的工艺如下酸化发酵液pHl. 4，搅拌、过滤，滤液用10% NaC03溶液调 节pH4. 5，用AmberlitelRC树脂纯化，用水洗柱，再用水+甲醇+NaCL溶液洗脱，洗脱液减 压浓缩，调节PH7. 5，用氯仿分三次萃取，有机相在pH3. 5条件下用水萃取，调节水相PH7. 5， 用氯仿分十次萃取，氯仿相在30°C减压浓缩为油状物，用10%盐酸乙醇溶液调节pH2. 7， 20士2°C静置20h析晶，过滤，用纯乙醇二氯甲烷=1 4的混合液和正己烷洗涤，低于35°C减压干燥，收率60. 5%，纯度80. 3%，总有关物质1.9%，水分1.8%，溶剂残留0. 1%, 此工艺虽收率有所提高、杂质含量得到控制，产品符合药典要求，但杂质B的含量仍较高， 不能满足用于对原料要求较高的制剂的需要，且使用正己烷不符合药典要求，炽灼残渣超 标。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的柔红霉素发酵液提取纯化方法。专利技术人经过大量实验研究发现，使用LX-20或LX-68M型大孔吸附树脂，并配合适 当的吸附和洗脱方法可以有效去除杂质B。专利技术人通过对金属离子络合剂的筛选，惊奇的发 现乙二胺四乙酸盐在一定PH范围内能够竞争被柔红霉素络合的金属离子，从而可以有效 降低炽灼残渣。本专利技术有针对性的去除杂质B，克服了炽灼残渣的残留。本专利技术提供的技术方案主要由以下步骤组成(1)发酵液用草酸液调节pH范围为1.0-4.0后添加助滤剂，用压滤机压滤，经过 0. lum钛棒过滤器过滤得澄清料液。(2)树脂装柱后用1.5倍于树脂体积的树脂预处理液进行冲洗预处理，控制流 速为500-3000L/h ；澄清料液用10 % NaOH溶液调节pH为2. 0-6. 0，上柱，控制流速为 100-800L/h，被吸附后用2倍于树脂体积的草酸水溶液冲洗，控制洗脱速度为500-3000L/ h ；再用30%乙醇水溶液洗脱，控制洗脱速度为500-3000L/h，TLC监测杂质B点基本消 失，盐酸柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；最后用70%乙醇水溶液洗脱，控制洗脱速度为 500-3000L/h, TLC监测盐酸柔红霉素点基本消失时停止洗脱，合并70%乙醇水溶液洗脱的 洗脱液进行下一步萃取。(3)用乙二胺四乙酸盐水溶液调节上步最后所得洗脱液pH至8. 0-10. 0，加入二氯 甲烷萃取，静置分液得有机相，将有机相合并后真空浓缩至原体积的1/4时停止浓缩进行 析晶，析晶、抽滤，干燥得粗品。步骤(1)中发酵液用草酸液调节pH范围为1.0-4.0，优选pH范围为1.5-2. 5;助 滤剂为硅藻土或珍珠岩粉，用量10-50kg/1000L发酵液，最佳用量20-30kg/1000L发酵液； 压滤机压滤压力0. 2-lMPa，最佳范围0. 4-0. 6MPa，钛棒过滤器过滤压力0. 2-0. 5MPa ；步骤(2)中大孔吸附树脂型号优选LX-20或LX-68M型；树脂预处理液是草酸 水溶液PH为2. 0-6. 0，优选pH范围为3. 5-4. 5，使用量是树脂体积的1. 5倍，控制流速为 500-3000L/h ；其中料液吸附后冲洗用草酸水溶液pH为2. 0-4. 5 ；所用30%乙醇水溶液，洗 脱前用草酸调节PH为2. 0-6. 0，优选pH范围为3-4. 5 ；所用70 %乙醇水溶液，洗脱前用草 酸调节pH为2. 0-6. 0，优选pH范围为3-4. 5。步骤(3)中配制乙二胺四乙酸盐的水溶液，浓度范围0. _饱和，最佳浓度范 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柔红霉素发酵液提取纯化工艺改进方法，包含以下步骤：（１）发酵液用草酸液调节ｐＨ范围为１．０－４．０，添加助滤剂，用压滤机压滤，经过０．１μｍ钛棒过滤器过滤得澄清料液；（２）树脂装柱后用１．５倍于树脂体积的树脂预处理液进行冲洗预处理，控制流速为５００－３０００Ｌ／ｈ；澄清料液用１０％ＮａＯＨ溶液调节ｐＨ为２．０－６．０，上柱，控制流速为１００－８００Ｌ／ｈ，被吸附后用２倍于树脂体积的草酸水溶液冲洗，控制洗脱速度为５００－３０００Ｌ／ｈ；再用３０％乙醇水溶液洗脱，控制洗脱速度为５００－３０００Ｌ／ｈ，ＴＬＣ监测杂质Ｂ点基本消失，盐酸柔红霉素点刚刚出现时停止洗脱；最后用７０％乙醇水溶液洗脱，控制洗脱速度为５００－３０００Ｌ／ｈ，ＴＬＣ监测盐酸柔红霉素点基本消失时停止洗脱，合并７０％乙醇水溶液洗脱的洗脱液进行下一步萃取；（３）用乙二胺四乙酸盐水溶液调节上步最后所得洗脱液ｐＨ至８．０－１０．０，加入二氯甲烷萃取，静置分液得有机相，将有机相合并后真空浓缩至原体积的１／４时停止浓缩进行析晶，析晶、抽滤，干燥得粗品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵志全，潘淑勇，
申请(专利权)人：山东新时代药业有限公司，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]