鸡卵类粘蛋白的纯化工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种鸡卵类粘蛋白的纯化工艺，而提供一种制备方法简单，成本低，有利于大规模生产的纯化工艺。在pH值为2.5-3.5的鸡卵类粘蛋白干粉粗品复溶所得水溶液或鸡卵类粘蛋白粗提液中加入硫酸铵至终浓度为50-70％(w/v)，4-25℃下放置4h以上，使杂蛋白沉淀，鸡卵类粘蛋白溶解，之后，4℃下离心，弃沉淀取上清液；所得上清液中再加入硫酸铵至终浓度为80-100％(w/v)，4-25℃下放置4h以上，使杂蛋白溶解，鸡卵类粘蛋白沉淀，之后，于4℃离心，弃上清液取沉淀，所得沉淀经透析除盐和冷冻干燥得到高纯度的鸡卵类粘蛋白。该纯化方法在保障高纯度的同时，制备方法简单，处理量大，方法重复性高，有利于大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
鸡卵类粘蛋白的纯化工艺
本专利技术涉及一种鸡卵类粘蛋白的纯化工艺。
技术介绍
鸡蛋具有营养全面且营养素配比平衡的特点，不仅是一种人类重要的食品，同时 也是重要的食品加工原料，被广泛应用于肉制品、糕点、面条、饼干等食品。但鸡蛋也是一种 主要的食物过敏原来源，目前国内外学者通常通过交叉放射免疫电泳、放射性过敏原吸收 试验、斑点免疫印记以及皮肤点刺试验检测数据认为鸡卵类粘蛋白（Hen-egg ovomucoid, 缩写为H0VM)是鸡蛋过敏反应中致敏性最普遍、最强的蛋白质，其对鸡蛋过敏人群的致敏 频率达34-97%。由于H0VM蛋白自身结构较为稳定，且对蛋白酶（特别是机体消化道蛋白 酶）具有抑制性能，造成该蛋白过敏原性很难消除，更甚之，即便利用蛋白酶酶解将其降解 成肽段，这些降解得片段仍保持一定的抗原性和过敏原性，因此如何消减H0VM蛋白的致敏 性是亟需解决的食品安全问题。而分析研究它的结构与性质，特别是其结构与其过敏源性 的关系是目前有效解决鸡蛋过敏的先决条件。 通常对鸡蛋中H0VM蛋白的结构、性质（特别是其过敏原性）及其过敏性消减方法 基础研究需要较高纯度的蛋白，同时用于制备预防H0VM致敏性的口服疫苗也需要较高纯 度的H0VM蛋白，因此分离纯化H0VM蛋白具有十分重要的意义。 目前从鸡蛋清中纯化H0VM蛋白的步骤主要包括两个阶段： 第一阶段主要是除去鸡蛋卵清中非H0VM的其它蛋白、制备H0VM蛋白粗品的过程， 主要利用H0VM蛋白较之于鸡卵清中其它蛋白较为特殊的溶解性能和耐受有机溶剂沉淀以 及抗变性的性能，常用利用三氯乙酸（TCA)、乙醇或丙酮除去鸡蛋清中非H0VM的杂蛋白。 第二阶段是在第一阶段所制备的H0VM粗品基础上，进一步纯化。通常的方法是先 利用沉淀法，利用乙醇、丙酮或硫酸铵等将H0VM沉淀出来，由于沉淀出来的H0VM纯度仍然 含有很多杂质，然后再通过分子筛层析、凝胶柱层析、离子交换柱层析、透析纯化等方法进 行纯化，得到纯度较高的H0VM。虽然利用层析技术获得H0VM蛋白可使所获蛋白的纯度得到 一定的提高，但是层析技术也存在一定的问题，如果用分子筛层析的方法，不仅成本高，且 处理量很小。利用离子交换法，处理量有一定的提升，但处理量还是较小，难以满足大规模 生产的需要，且所用树脂介质较贵，生产成本较高，技术也较为繁琐，无法实现工业化生产， 从而使得H0VM的制造成本大大提高，大规模生产得到限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种制备方法简单，成 本低，有利于大规模生产的鸡卵类粘蛋白的纯化工艺。 为实现本专利技术的目的所采用的技术方案是： 一种鸡卵类粘蛋白的纯化工艺，包括下述步骤：在pH值为2.5-3.5的鸡卵类 粘蛋白干粉粗品复溶所得水溶液或鸡卵类粘蛋白粗提液中加入硫酸铵至硫酸铵终浓度 为50-70% (w/v)，4-25°C下放置4h以上，使杂蛋白沉淀，鸡卵类粘蛋白溶解，之后，4°C下 离心，弃沉淀取上清液；所得上清液中再加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为80-100% (w/v)， 4-25°C下放置4h以上，使杂蛋白溶解，鸡卵类粘蛋白沉淀，之后，于4°C离心，弃上清液取沉 淀，所得沉淀经透析除盐和冷冻干燥得到高纯度的鸡卵类粘蛋白。 所述鸡卵类粘蛋白粗提液通过下述方法得到：取新鲜的鸡蛋，手工分离蛋清与蛋 黄，得到蛋清并量取体积，加入等体积去离子水进行稀释，4°C下磁力搅拌2. 0h，然后于4°C 条件下4, OOOXg离心，弃沉淀与不溶物，上清液即为所得预处理蛋清溶液；在所得预处理 蛋清溶液中缓慢加入pH值为1. 15、浓度为10% (w/v)的三氯乙酸溶液并混合均匀，其中， 预处理蛋清溶液与三氯乙酸溶液的体积比例为1 : 1，然后再用浓度为1.0m〇l/L的NaOH溶 液调节混合溶液至pH值2. 5-3. 5,室温下静置4h以上，于4°C条件下4, 000 X g离心，弃沉 淀取上清液，所得上清液经透析去除三氯乙酸，得到鸡卵类粘蛋白粗提液。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是： 1、本专利技术的鸡卵类粘蛋白的纯化工艺在特定的pH值条件下，通过第一步盐析控 制硫酸铵的浓度使得杂蛋白沉淀，鸡卵类粘蛋白溶解，从而去掉大量的杂蛋白，提高了鸡卵 类粘蛋白的纯度。在此基础上，再通过第二次盐析控制硫酸铵的浓度使得鸡卵类粘蛋白沉 淀，其他杂蛋白溶解的方式，得到了高纯度的鸡卵类粘蛋白，在保障高纯度的同时，制备方 法简单，所用原料价格便宜，所得产品的成本低。 2、本专利技术的纯化工艺采用两步盐析得到高纯度的鸡卵类粘蛋白，工艺简单，处理 量大，方法重复性高，有利于大规模生产。对于研究该蛋白结构与过敏原性的关系及其消减 该蛋白过敏原性的方法提供了前提条件，也为提取高纯度的鸡卵内粘蛋白作为胰蛋白酶抑 制剂的工业化制备提供了可靠的保障。 3、本专利技术的纯化工艺采用物理方法进行纯化，两步盐析分别得到的目的蛋白不 同，避免了有机溶剂等的影响，能够很好的保留产品的活性，研究结果可靠性高，同时满足 环保要求。 【附图说明】 图1所示为按照实施例1所得H0VM蛋白样品在检测波长为220nm下HPLC法纯度 检测色谱图； 图2所示为按照实施例2所得H0VM蛋白样品在检测波长为220nm下HPLC法纯度 检测色谱图。 【具体实施方式】 以下结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。 实施例1 (1)取5个新鲜的鸡蛋，手工将蛋清与蛋黄分离，量筒量取体积，加入等体积的去 离子水进行稀释，4°C下磁力搅拌2. 0h，然后于4°C条件下4, 000 X g离心15min，弃沉淀与不 溶物，上清液即为所得预处理蛋清溶液。 (2)预处理蛋清溶液中缓慢加入等体积的TCA溶液并混合均匀，所用TCA溶液的 pH值为1.15、浓度为10% (w/v)，即预处理蛋清溶液与TCA溶液的比例为1 : 1.0,然后再 用浓度为1. Omol/L的NaOH溶液调节混合溶液pH值至2. 5,室温下静置4h以上，于4°C条件 下4, 000 X g离心15min，所得上清液再进一步进行透析去除TCA，透析完所得溶液即为H0VM 粗提液。 (3)在所得pH值为2. 5的H0VM粗提液中缓慢加入硫酸铵至其终浓度为50% (w/ v)，4°C下静置4h，于4°C条件下4, OOOXg离心15min后弃沉淀取上清液；继续向上清液中 加入硫酸铵使其终浓度为80% (w/v)，4°C下静置4h后于4°C条件下4, 000X g离心15min， 弃去上清液取沉淀，所得沉淀复溶于20. 0ml去离子水中，过夜透析除盐后冻干得到卵类粘 蛋白样品。经计算H0VM的提取率为27. 04%，采用HPLC液相检测，结果如图1所示，所得 H0VM的纯度为99. 202%。 实施例2 (1)取5个新鲜的鸡蛋，手工将蛋清与蛋黄分离，量筒量取体积，加入等体积的去 离子水进行稀释，4°C下磁力搅拌2. 0h，然后于4°C条件下4, 000 X g离心15min，弃沉淀与不 溶物，上清液即为所得预处理蛋清溶液。 (2)预处理蛋清溶液中缓慢加入等体积本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡卵类粘蛋白的纯化工艺，其特征在于，包括下述步骤：在pH值为2.5‑3.5的鸡卵类粘蛋白粗提液或鸡卵类粘蛋白干粉粗品复溶所得水溶液中加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为50‑70％(w/v)，4‑25℃下放置4h以上，使杂蛋白沉淀，鸡卵类粘蛋白溶解，之后，4℃下离心，弃沉淀取上清液；所得上清液中再加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为80‑100％(w/v)，4‑25℃下放置4h以上，使杂蛋白溶解，鸡卵类粘蛋白沉淀，之后，于4℃离心，弃上清液取沉淀，所得沉淀经透析除盐和冷冻干燥得到高纯度的鸡卵类粘蛋白。

【技术特征摘要】
1. 一种鸡卵类粘蛋白的纯化工艺，其特征在于，包括下述步骤：在pH值为2. 5-3. 5的 鸡卵类粘蛋白粗提液或鸡卵类粘蛋白干粉粗品复溶所得水溶液中加入硫酸铵至硫酸铵终 浓度为50-70% (w/v)，4-25°C下放置4h以上，使杂蛋白沉淀，鸡卵类粘蛋白溶解，之后，4°C 下离心，弃沉淀取上清液；所得上清液中再加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为80-100% (w/v)， 4-25°C下放置4h以上，使杂蛋白溶解，鸡卵类粘蛋白沉淀，之后，于4°C离心，弃上清液取沉 淀，所得沉淀经透析除盐和冷冻干燥得到高纯度的鸡卵类粘蛋白。2. 根据权利要求1所述的鸡卵类粘蛋白的纯化工艺，其特征在于，所述鸡卵类粘蛋白 粗提...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴子健，王帅，帖航，胡志和，刘建福，吕瑜峰，
申请(专利权)人：天津商业大学，
类型：发明
国别省市：天津;12