一种快速检测耐盐ＩｒｒＥ蛋白的试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及一种快速检测耐盐ＩｒｒＥ蛋白的试剂盒，包括盒体、测试带和上盖，盒体盖入上盖后组成试剂盒，其特征在于所述测试带位于盒体内表面，且所述上盖设置有一个观测窗和一个加样孔。本试剂盒可为快速检测植物种子、叶片及加工产品中是否含有耐盐ＩｒｒＥ蛋白基因成份提供直接证据，不需其它任何附加仪器设备。本试剂盒操作简便、检测结果形象、准确、快速：只要将送检物品的提取液滴加在试剂盒的加样孔中，３－５分钟后，通过肉眼就可从观测窗直接观察到准确的检测结果。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种快速检测耐盐IrrE蛋白的试剂盒。技术背景IrrE是具有极端辐射抗性的耐辐射球菌Deinococcus radiodurans中的全局调 控因子，其对辐射胁迫后该菌的DNA修复和保护途径起到十分重要的调控作用。研究显示 irrE基因的表达能显著增强大肠杆菌的辐射抗性、氧化抗性和耐盐能力。该基因导入植物 后，明显提高了植物的耐盐和抗旱能力。转irrE基因烟草可在含250mmol的NaCl培养基 上正常生长，而非转基因烟草在250mmol的NaCl培养基上不能生长。转IrrE基因的油菜 具有耐受350mM NaCl的能力，进一步证实irrE基因可能是植物耐盐抗性的有效目标基因。 目前，IrrE蛋白编码基因已转入玉米、棉花、烟草、油菜等作物。在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要 对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。现有的检测技术如酶免、放免等方法，受仪器(酶标仪、放免闪烁仪、离心机等)、 场地等因素的限制，而且检测时间长(酶免检测时间需20hr、放免需30min lhr)，检测成 本较高，很难推广应用。因此，实践中需要有一种可快速检测转基因作物中耐盐IrrE蛋白， 且操作简便、结果准确可靠、快速的装置。
技术实现思路
本技术的目的是建立一种操作简便、结果准确可靠、快速检测转基因成分 (IrrE蛋白)的免疫检测试剂盒。本技术的技术方案是一种快速检测耐盐IrrE蛋白的试剂盒，包括盒体、测试带和上盖，盒体盖入上盖 后组成试剂盒，其特征在于所述测试带位于盒体内表面，且所述上盖设置有一个观测窗和 一个加样孔。优选的方案是，所述盒体内表面设置有可以嵌入所述测试带的凹槽。盒体的深度不限。所述盒体或上盖可具有卡槽，以保证盒体与上盖扣紧。所述观测窗优选是长方形。试剂盒的形状优选为哑铃形。所述观测窗优选是长方形，观测窗分为测试区(T)和质控区(C)两部分，可在上盖 上用字母C、T标示出。所述测试带形状为长方形片状，用于检测耐盐IrrE蛋白。所述测试带是一种具有检测系统主体膜反应体系功能的检测材料，由高分子纤维 膜、塑料等多层材料制成。测试带分为质控区和检测区，质控区可包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠 IgG多克隆抗体；耐盐IrrE蛋白测试带的样品检测区包被特异功能性IrrE单克隆抗体或 多克隆抗体。外源基因转入植物，并在植物中表达后，所产生目的蛋白(IrrE)可通过抗原抗体特异性反应来检测样品中是否含有该蛋白来确定该基因是否存在。如果外源基因转入植 物，发生基因沉默，无目的蛋白产生，将不能达到预期目的(耐盐IrrE)。本技术的目的是这样实现的当盒体盖入上盖后，观测窗和加样孔对应测试 带，通过盒盖上的加样孔和观测窗可进行加样和观察检测结果。观测窗分为测试区(T)和质控区(C)两部分，可在上盖上用字母C、T标示出；检测时，将送检物品的提取液滴加在试剂盒的加样孔中，3-5分钟后，通过肉眼就 可以通过上盖的观测窗直接观察到准确的检测结果。对于每个观测窗来说，用以下方式判断检测结果1、阴性(-)反应状况观测窗质控区(C)出现一条紫红色条带。检测结果待检样品中不含待检基因或其含量在其阈值以下。2、阳性(+)反应状况观测窗质控区(C)出现一条紫红色条带，在测试区(T)内同时出现紫红 色条带。检测结果待检基因含量在阈值以上。3、无效反应状况质控区(C)未出现紫红色条带，检测结果表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。本技术所述试剂盒的优点在于经济高效使用成本低廉，保存方便；简便快速检测转基因成份一步法操作，不需任何附加设备。直接将待测样品液滴 加在加样孔中，3-5分钟可出结果；结果直观不借助任何仪器对抗原进行检测，用肉眼可观察到结果；准确可靠灵敏度高、特异性强；应用广泛可检测玉米、棉花、烟草、油菜等多种农作物的叶片、种子及加工产品。由于本技术提供的试剂盒可对植物样品进行IrrE分析，检测快速、特异、敏 感、方便，特别适用于转基因产品的研制开发和转基因产品的快速筛选，可用于实验室、田 间、边防、海关植物检验、检验检疫局、食品安全检测及种子经营销售等部门对可疑样本现 场、快速筛查。附图说明图1和图2是本技术一种试剂盒的结构示意图，其中图1是盒体的俯视图，图 2是试剂盒上盖的俯视图；图中1是加样孔，2是观测窗，3是测试带，C是质控区，T是测试区。具体实施方式本技术试剂盒中的测试带的制备说明实施例1制备测试带1.耐盐IrrE单抗腹水的制备小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL。1周后，将耐盐IrrE单抗杂交瘤细胞注射于以上预先处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞1 3X 106。10天后收获腹水， 以上过程皆在无菌条件下完成。2.耐盐IrrE单克隆抗体的纯化1)以DEAE离子交换层析及S印hacryl S-300分子筛对单抗进行纯化；SDS-PAGE 平板电泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；2)纯化过程取小鼠单抗腹水一3，000 X g离心15分钟一上清液加50 %硫酸铵沉 淀，过夜一3，000 X g离心20分钟一沉淀溶于0. 01M磷酸盐缓冲液(pH 7. 2) — S-300凝胶 柱一DEAE Blue层析柱一0-800mMNaCl梯度洗脱一超滤离心，浓缩单抗；3)单抗纯度测定常规SDS-PAGE电泳，上述方法所纯化的单抗的纯度皆在95%以 上；4)蛋白浓度测定紫外分光光度计测定279nm处的0D值，按以下公式计算蛋白含 量0D279/1.4 = mg/mL(纯化单抗)。将单抗浓度调节为约lmg/mL ；5)单抗活性测定选用IrrE抗原包被ELISA板(1 P g/孔)，及羊抗鼠IgG-HRP复 合物，测定各单抗效价(大于1 5000)。3.羊抗D0AT高效价免疫抗血清的制备和纯化1)纯化好的上述单抗+完全佐剂一免疫山羊一加强免疫二次，每次间隔一月一第 二次加强后10天左右取血一离心取血清一硫酸铵沉淀一DEAE离子交换层析纯化；2)效价测定ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于1 256;3)蛋白浓度测定紫外分光法测定0D279，计算蛋白浓度。4.胶体金及金标抗体制备1)胶体金的制备以柠檬酸盐还原法制备40-60nm的胶体金。将0. 01 % HauCl4 加热至沸，加入一定量的柠檬酸三钠(Na3C6H507 *2H20)，继续加热煮沸5分钟，待胶体金 溶液颜色由兰一紫一红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期保存，可加入 0. 02% NaN3。2)将胶体金液500mL用0. 1M NaOH调pH8. 4，磁力搅拌下缓慢加入单抗2mL，搅拌 20分钟。5，500Xg离心30Min，除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体金标记抗 体沉淀，沉淀溶于10mL保存液中，用0. 45 y m微孔滤膜过滤。取样进行检定，其余置4°C保存。5.膜反应体系Ml的制备1)将IrrE抗体及纯化的羊抗鼠IgG以0. 1M磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约 0. 2-2mg/mL。2)纯化的羊抗鼠IgG溶于0. 1M磷酸盐缓冲液中，浓度为2. Omg/mL ；3)硝酸纤维素膜大小10cmX 27cm，每张膜可喷长25cm的检测及控制带本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测耐盐ＩｒｒＥ蛋白的试剂盒，包括盒体、测试带和上盖，盒体盖入上盖后组成试剂盒，其特征在于所述测试带位于盒体内表面，且所述上盖设置有一个观测窗和一个加样孔。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张维，刘奇，周正富，郑建，陈明，林敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：实用新型
国别省市：11[中国|北京]