一种确定牛乳过敏原表位关键氨基酸的方法技术

一种确定牛乳过敏原表位关键氨基酸的方法，根据初步确定的模拟表位区氨基酸序列，合成表位肽段，固定和保护，其Ｃ端共价结合到活化的纤维膜上，Ｎ端被乙酰化；用单个甘氨酸作为阴性对照，将合成的氨基酸序列与多克隆血清反应，确定β－乳球蛋白的主要表位；将主要表位中的每个氨基酸依次被丙氨酸或甘氨酸取代，得到需合成的氨基酸序列；将得到的氨基酸序列，合成表位肽段，固定和保护，其Ｃ端共价结合到活化的纤维膜上，Ｎ端被乙酰化；用单个甘氨酸作为阴性对照，将合成的氨基酸序列与多克隆血清反应，确定牛乳表位中的关键氨基酸。本发明专利技术可为乳过敏的诊断、治疗以及食品中过敏原的检测奠定基础，为开发低过敏性牛乳提供理论依据和技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别涉及表位的精确定位。
技术介绍
牛乳过敏是一种常见的食物过敏反应，1-2%的成人和高达8%的三岁以下儿童会 对牛乳产生食物过敏反应。牛乳中含有将近20种蛋白质都具有潜在的致敏性，据报道牛乳 过敏人群对牛乳的过敏一般表现为对多个蛋白的共过敏。乳球蛋白、a-乳白蛋白、酪 蛋白被认为是主要的过敏原，其他蛋白如牛血清白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白在过敏反应 中也起着非常重要的作用，有大约30% 50%的牛乳过敏者对这些微量蛋白过敏，且其中 有些患者只对这些微量蛋白过敏。日-乳球蛋白占牛奶总蛋白的10%，乳清蛋白的50%。3 _乳球蛋白是公认的主 要乳过敏原之一，大约82%的牛乳过敏患者对乳球蛋白过敏。母乳中不存在乳球 蛋白，这也是其成为主要过敏原的原因之一。同时，乳球蛋白属lipocalin蛋白家族， lipocalin蛋白具有相同的由重复排列的8或10个反向平行的折片组成的桶状结 构。由于其复杂的结构，lipocalin蛋白家族中许多蛋白质具有强的致敏性，一些动物源性 过敏原都属于这类蛋白，如马的主要过敏原Equ c 1、主要的鼠蛋白等。乳球蛋白耐酸 和耐蛋白酶水解。因此，消化后人体内还存在着完整的乳球蛋白及其肽段，可能会引起 过敏反应。日-乳球蛋白的存在形式与pH值有关，在鲜牛乳中(pH6. 6 6. 8)，它是以二聚体 的形式存在，当PH低于3. 5时，二聚体离解成单体，pH在3. 5 5. 2之间时，二聚体四聚化 形成八聚体，PH高于7. 5时，二聚体解离且构象发生变化形成膨胀的单体。0 _乳球蛋白一 般是二聚体，其每个单体为18kDa，含有162个氨基酸，5个二硫键，其中4个为链内，1个为 链间。“水牛奶中3 -乳球蛋白过敏原表位定位的初步研究”(《食品科学》2007，vol. 28， No. 10, P360-363)中公开了水牛奶中0 _乳球蛋白过敏原表位定位的初步研究结果，即 利用免疫亲和纯化的特异性兔血清对噬菌体随机七肽库进行亲和淘选，并借助网络工具 MIM0X分析，确定乳球蛋白过敏原的表位区，但不能确定其中的关键氨基酸。
技术实现思路
本专利技术的目的是在确定过敏原表位区的基础上，加入对表位的理论预测以及通过 噬菌体展示技术和肽扫描相结合的方法对牛奶中0"乳球蛋白进行正确和全面的表位定 位并进一步确定其中的关键氨基酸。本专利技术是通过以下技术方案实现的。1、根据初步确定的模拟表位区氨基酸序列，合成表位肽段，并固定和保护，合成肽 段的c端共价结合到活化的纤维膜上，N端被乙酰化；2、用单个甘氨酸作为阴性对照，将合成的氨基酸序列与多克隆血清反应，根据反应的强度，确定乳球蛋白的主要表位；3、将乳球蛋白的主要表位中的每个氨基酸依次被丙氨酸或甘氨酸取代，得到 需合成的氨基酸序列；4、由步骤3得到的氨基酸序列，再合成表位肽段，并固定和保护，合成肽段的C端 共价结合到活化的纤维膜上，N端被乙酰化；5、用单个甘氨酸作为阴性对照，将合成的氨基酸序列与多克隆血清反应，根据反 应的强度，确定牛乳表位中的关键氨基酸。本专利技术以生物信息学预测B细胞表位的结果为基础，采用相应的多克隆抗体为 靶分子，通过噬菌体展示技术和肽扫描技术精确定位乳球蛋白的线性表位，可为阐明乳球蛋白过敏的物质基础，进行乳过敏的诊断、治疗以及食品中过敏原的检测奠定基 础，为开发低过敏性牛乳提供理论依据和技术支持，同时该方法也为其它食物过敏原表位 的精确定位提供新的途径。附图说明图1为DANStar软件多参数预测结果。图2为亲水性、a -螺旋，日-转角和日-折叠的预测结果。图3为本专利技术MIM0X序列比对的界面。图4为本专利技术112个模拟表位中氨基酸对应的乳球蛋白位点。图5为肽扫描结果。图6为1#兔血清识别不同肽段的强度。图7为3#兔血清识别不同肽段的强度。图8为4#兔血清识别不同肽段的强度。图9为氨基酸置换方法确定关键氨基酸。具体实施例方式本专利技术将通过以下实施例作进一步说明。实施例。本实施例所选材料纯度达90%以上水牛乳0 _乳球蛋白，相应的多克隆抗体，滴 度达1 40万以上。所用水牛乳0 -乳球蛋白的制备为以下步骤以 DEAE-S印harose Fast Flow 阴离子交换(1. 2cmX 30cm)进行分离，先用 pH6. 8， 0. 02mol/L磷酸盐起始缓冲液平衡离子交换柱；取适当稀释超滤后的乳清，上样；pH6. 8， 0. 02mol/L磷酸盐平衡缓冲液洗脱未被吸附的蛋白质，约200mL ；含0 0. 5mol/L NaCl磷 酸盐缓冲液连续洗脱被吸附的蛋白质，洗脱速度为1. 5mL/min ；收集目标洗脱峰，用截流分 子量5kDa Amicon Ultra_15超滤离心管超滤浓缩至1/50体积超滤浓缩后的离子交换目标 产物上S印hadexG-75凝胶层析柱(1. 2cmX 75cm)进一步分离装柱，将柱材用真空泵脱气； 0. 02mol/L pH6. 8的磷酸盐缓冲液平衡凝胶层析柱；平衡后，上样；0. 02mol/L pH6. 8的磷 酸盐缓冲液洗脱，洗脱速度8mL/h。收集目标峰，超滤浓缩至1/50体积。得到的纯化的目 标蛋白，采用SDS-PAGE、IEF-PAGE和ESI-Q-T0F-MS进行鉴定，其纯度高达90%以上，并适用于实验室小量和中量制备。以纯化的牛乳乳球蛋白为抗原，初次免疫用弗氏完全佐剂；加强免疫用弗氏 不完全佐剂；免疫途径以皮下多点注射方式进行每只兔子lmg/mL每两周免疫一次，共免疫 4次。采用方阵滴定确定最佳包被浓度，间接ELISA跟踪抗体效价达1 40万以上；再通 过间接ELISA、竞争抑制ELISA以及免疫印迹实验，证明分离纯化的牛乳乳球蛋白的抗 原性完好，水牛乳乳球蛋白与牛乳乳球蛋白存在较强的免疫交叉反应，其交叉率达 到 69. 27%。2、方法2. 1多参数预测水牛乳0 -乳球蛋白抗原线性表位结果利用DNAStar软件对水牛乳乳球蛋白氨基酸序列进行表位相关参数的理论预 测，如图1所示，可能构成抗原区的位置如表1。表IDANStar软件预测的表位区 通过网络服务器，我们再次对牛乳0 -乳球蛋白的抗原区进行预测，图2和表2显 示了水牛乳乳球蛋白的亲水性、a-螺旋、转角和折叠的预测分析结果。表2亲水性、a -螺旋，0 -转角和0 -折叠的存在的可能位点 *通过Kyto&Dolittle分析的结果，**通过Welling分析的结果。综合以上的预测分析，我们得到了水牛乳乳球蛋白可能的抗原表位区 AA30-45, AA67-78, AA97-115，AA124-141, AA150-156。2. 2噬菌体随机肽库定位2. 2. 1噬菌体随机七肽库筛选将纯化的多克隆抗体IgG用包被缓冲液(0. lmol/LNaHC03,pH 8. 6)稀释至10 u g/ mL,每孔100 u L包被96孔酶标板，4°C轻微震荡，孵育过夜。弃去包被液，每孔加满封阻液 (0. lmol/LNaHC03, 5mg/mLBSA, 0. 02 % 的 NaN3)，4C 封阻 2h ；用 TBST (50mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl,0. 1% Tween-20)快速洗板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定牛乳过敏原表位关键氨基酸的方法，利用免疫亲和纯化的特异性兔血清对噬菌体随机七肽库进行亲和淘选，并借助网络工具ＭＩＭＯＸ分析，确定β－乳球蛋白过敏原的表位区，其特征是：（１）根据初步确定的模拟表位区氨基酸序列，合成表位肽段，并固定和保护，合成肽段的Ｃ端共价结合到活化的纤维膜上，Ｎ端被乙酰化；（２）用单个甘氨酸作为阴性对照，将合成的氨基酸序列与多克隆血清反应，根据反应的强度，确定β－乳球蛋白的主要表位；（３）将β－乳球蛋白的主要表位中的每个氨基酸依次被丙氨酸或甘氨酸取代，得到需合成的氨基酸序列；（４）由步骤３得到的氨基酸序列，再合成表位肽段，并固定和保护，合成肽段的Ｃ端共价结合到活化的纤维膜上，Ｎ端被乙酰化；（５）用单个甘氨酸作为阴性对照，将合成的氨基酸序列与多克隆血清反应，根据反应的强度，确定牛乳表位中的关键氨基酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李欣，陈红兵，高金燕，文学方，吴志华，杨安树，佟平，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]